生物制備全煙草組分再造煙葉及結構特性分析

丁一郎，葉建斌，楊金初，胡仙妹，尹獻忠，李 鵬，李浩亮，張 展*，楊雪鵬*

1. 鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，鄭州高新技術產業開發區科學大道136號 4500012. 莆田學院，福建省莆田市城廂區學園中街1133號 3511003. 河南中煙工業有限責任公司技術中心，鄭州市管城區隴海東路72號 4500004. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001

加熱卷煙是一種依賴加熱設備為輔助抽吸工具的新型煙草制品，其在低溫下（一般不超過400 ℃）加熱使用，可以避免煙草特有亞硝胺、焦油以及潛在有害成分等的生成［1］。在滿足吸食者體驗感和滿足感［2］的同時，有效提高了煙草制品的安全性。加熱卷煙的原料包括再造煙葉、煙絲及煙草顆粒等［3］。其中再造煙葉因具有成本低、有害物質少、成分調控靈活等優點，成為目前市售加熱卷煙的主要原料［4］。用于加熱卷煙的再造煙葉的生產工藝主要有造紙法、輥壓法、稠漿法3種。目前，絕大多數再造煙葉配方中需要添加木漿纖維、黏合劑、香精香料等，用以提高物料的黏結性、改善片基強度、豐富再造煙葉香氣，從而保障加熱卷煙的品質［5］。然而，外加纖維或黏合劑等導致的木質雜氣、苦味會使煙氣粗糙，香吃味變差，且部分香精香料與煙草本香還存在一定程度的不協調。因此，尋找一種與加熱卷煙基材相適配、能有效負載香氣的纖維材料，有望減少或取代木漿纖維、黏合劑的使用，同時還可以改善加熱卷煙原料的煙草本香。

細菌纖維素（Bacteria cellulose，BC）是一類由細菌胞外合成的多糖［6］，與植物纖維素相比，具有純度高、持水性好、機械拉伸性能強［7］等特點。同時納米級纖維結構展現了良好的生物相容性［8］，被廣泛應用于食品、紡織、醫療等領域［9］。張婷婷等［10］報道了利用廢棄煙葉為底物發酵合成細菌纖維素，有利于將浸提液中的煙堿及香味物質均勻吸附到細菌纖維素的細微網格結構中，較好保留了煙草原味物質，賦予細菌纖維素豐富的煙草特點。同時，這種利用生物技術的方法處理煙草廢棄物得到的細菌纖維素可有效降低生產成本［11］。據此，以煙草廢棄物為原料，首先利用生物發酵得到負載天然煙草成分的細菌纖維素，然后通過重新組合發酵剩余的浸提液、原料以及合成的細菌纖維素，結合輥壓法和稠漿法的生產工藝，制成一種物理結構良好、香氣成分充足、加工性能優良的再造煙葉，旨在減少或不加入木漿纖維、黏合劑等外加添加劑，為開發高性能加熱卷煙用新型再造煙葉提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

廢棄煙末（由河南中煙工業有限責任公司黃金葉制造中心提供）；木醋桿菌Acetobacter xylinusYB（由鄭州輕工業大學自主篩選保藏）；造紙法再造煙葉（SH-01）、稠漿法再造煙葉（SH-02）、造紙法再造煙葉（SH-03），3種再造煙葉來源于市售加熱卷煙（配方中使用木漿纖維、煙用香精香料等）；BC重組再造煙葉（CZ-01）（自制）。

無水葡萄糖（AR，天津市大茂化學試劑廠）；酵母浸粉（AR，北京奧博星生物技術有限公司）；制霉菌素（AR，阿拉丁試劑有限公司）；丙三醇（AR，天津富宇精細化工有限公司）。

CDS 5250-T/7890B-5977A型熱裂解-氣相色譜/質譜聯用儀（北京萊伯泰科儀器股份有限公司、美國Agilent公司）；JSM-7001F型場發射掃描電子顯微鏡（日本電子株式會社）；STA449F3 型同步熱分析儀（德國耐馳儀器公司）；Vertex 70 型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Bruter 公司）；BSA2202S 型電子天平（感量0.0001 g，北京賽多利斯儀器有限公司）；BHZ-1 型薄片厚度計（四川長江造紙儀器有限責任公司）；ZKW-3 型煙草薄片抗張試驗機（四川長江造紙儀器有限責任公司）；DGG-9140 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；AA3 型連續流動分析儀（德國布朗盧比公司）；7890B 型氣相色譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 細菌纖維素制備

種子培養基制備：無水葡萄糖70 g、酵母浸粉10 g，用1 L去離子水定容后115 ℃滅菌20 min。

煙草浸提液制備：廢棄煙末400 g、去離子水5 L，60 ℃浸提1.5 h，過濾后121 ℃滅菌20 min。

細菌纖維素培養：接種量6%、培養12 h 后分裝培養盒繼續培養7 d左右，收獲細菌纖維素。

1.2.2 重組再造煙葉制備

原料處理：將上述用于制備煙草浸提液的廢棄煙末過濾后烘干，同其他未利用的廢棄煙末研磨成粉，細菌纖維素打碎成漿狀。按質量比1∶5添加煙粉和細菌纖維素漿，添加占煙粉質量20%的甘油，混合均勻。

再造煙葉成型：漿料均勻鋪在襯布和紙帶間輥壓，輥間距為（1.2±0.1）mm，成型后裁切成長（14.0± 0.5）cm 和寬（12.0 ± 0.5）cm 的矩形薄片，放置60 ℃烘箱內干燥30～60 min 至含水率為15%～18%，獲得BC重組再造煙葉。

工藝流程如圖1所示。

圖1 BC重組再造煙葉生產加工流程圖Fig.1 Flow chart of manufacturing of BC reconstituted tobacco

1.2.3 紅外光譜分析

先將4種再造煙葉研磨成粉，再與光譜級溴化鉀粉末以m（煙粉）∶m（溴化鉀粉末）=1∶100的質量比在瑪瑙缽中混合研磨，用壓片機以10 MPa 壓力壓片，用紅外光譜儀進行結構表征，掃描范圍為400～4000 cm-1，掃描次數64次。

1.2.4 場發射掃描電鏡觀察

將冷凍干燥處理后的4 個樣品用導電膠粘在銅座上，噴金處理120 s，將鍍金后的樣品放入儀器真空系統中，加速電壓5 kV，調整放大倍數和拍攝區域，在200～20000倍之間觀察各樣品形貌，選取清晰的纖維圖片進行樣品微觀結構分析。

1.2.5 物理性能測定

按照國標和行業標準［12-14］中的方法對再造煙葉的厚度、定量、松厚度、抗張強度進行測定和計算，對比物理指標差異。

1.2.6 熱性能分析

樣品分析前，設置同步熱分析儀在800 ℃下保持10 min，排凈爐體雜質，分別稱取（10.0±0.1）mg樣品置于熱重坩堝內進行測試，氮氣氣氛下，升溫程序為初始溫度30 ℃，升溫速率10 ℃/min，升至800 ℃，保持10 min；空氣流量50 mL/min。

1.2.7 化學成分分析

化學成分測定：將4 種再造煙葉放置于溫度（22±1）℃、相對濕度60%±2%的環境中平衡48 h，按照行業標準［15-16］中的方法測定再造煙葉中的煙堿和水溶性總糖含量。

熱裂解條件：初始溫度80 ℃，以100 ℃/min升至120 ℃并保持2 min；然后以20 ℃/s 升至300 ℃并保持30 s。

氣相色譜條件：毛細管色譜柱DB-5 MS（50 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為高純氦氣；進樣口溫度280 ℃；分流比為50∶1；色譜柱流量1.0 mL/min；升溫程序為初始溫度40 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。質譜條件：電子轟擊（EI）電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度300 ℃；離子源溫度230 ℃；溶劑延遲2 min；質量掃描范圍：33～450 amu；掃描方式：全掃描。圖譜庫：NIST11。

2 結果與討論

2.1 BC重組再造煙葉形貌分析

制備的BC重組再造煙葉樣品如圖2所示，觀察可見其均質化程度較高，孔隙少。比較再造煙葉正反兩面差異，背面色澤略深，質地較光滑；正面顏色較淺，質地較粗糙。與以往再造煙葉中添加的木漿纖維不同，BC重組再造煙葉采用具有黏性的納米級超細纖維，能夠取代黏合劑和外加木漿纖維，促進再造煙葉成型，說明該工藝可行性良好。

圖2 BC重組再造煙葉正反面外觀（3024×4032 像素）Fig.2 Front and back appearances of BC reconstituted tobacco

2.2 物理性能測定

4種樣品的厚度、定量、松厚度、抗張強度測量結果如表1所示。通過對比可以看出，4種再造煙葉物理性能指標存在一定差異。造紙法再造煙葉（SH-01、SH-03）的纖維排列疏松，存在較多孔隙，因此其定量和抗張強度值較小、松厚度值較大；稠漿法再造煙葉（SH-02）的纖維直徑較小且結構致密，故具有較高的定量和抗張強度、較小的松厚度；BC 重組再造煙葉（CZ-01）的纖維細長、密度大，交織纏繞使得結構更加致密，有利于通過增加其定量和抗張強度展現更佳的機械性能［17］。此外，BC重組再造煙葉（CZ-01）與稠漿法再造煙葉（SH-02）的物理指標相接近，其原因可能是兩者具有相似的配方和結構。

表1 4種再造煙葉的物理指標測量結果Tab.1 Physical indicators of four reconstituted tobacco samples

2.3 紅外光譜分析

4種再造煙葉的紅外光譜對比見圖3。由圖3可知，BC 重組再造煙葉和3 種市售加熱卷煙再造煙葉的紅外吸收情況基本相同。波數3434 cm-1處的峰形較寬，歸屬于纖維素分子間和分子內氫鍵引起的O-H伸縮振動；波數2925 cm-1處的吸收峰歸屬于亞甲基C-H的伸縮振動；波數1620 cm-1處為纖維素4’端半縮醛基吸收峰［18］；波數1335 cm-1和1415 cm-1處發生纖維素和半纖維素-CH3的對稱彎曲振動和-CH2的剪式彎曲振動；1105 cm-1處的吸收峰歸屬于C-C骨架振動；波數1045 cm-1處是C-O單鍵的振動吸收峰，推測是霧化劑中具有伯醇結構的醇類物質［19］；918 cm-1處是β-D 糖苷鍵面內彎曲振動吸收峰。BC重組再造煙葉與3種樣品的官能團特征吸收峰相同，具有相似的化學官能團，說明BC 重組再造煙葉沒有引入特殊的化學雜質。

圖3 4種再造煙葉的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of four reconstituted tobacco samples

2.4 場發射掃描電鏡觀察

4 種再造煙葉的微觀電鏡圖見圖4。由圖4 可知，SH-01再造煙葉表面較平整，纖維呈扁平狀、無序結構排列。SH-02再造煙葉的纖維表面被細微的煙粉顆粒包裹、較光滑，周圍存在明顯的孔隙。SH-03再造煙葉可以觀察到較多的桿狀纖維，層狀堆疊、結構松散且上面附著有較大的煙粉團粒。CZ-01 重組再造煙葉的質地較為均勻，在相同放大倍數下其組織結構較其他再造煙葉更加致密緊實。

圖4 200倍下4種再造煙葉表面形貌圖Fig.4 Surface morphology of four reconstituted tobacco samples（×200 times）

為進一步比較各種再造煙葉內部結構，在掃描電鏡下放大合適倍數進而比較相應的纖維形狀。由圖5 可知，SH-01 纖維縱橫交錯、粗細不均，直徑在2.90～10.34 μm之間。SH-02纖維表面存在褶皺，細碎煙粉顆粒較多，裸露出的纖維較細，直徑在0.51～2.52 μm。SH-03 粗纖維直徑在18.24～27.24 μm。CZ-01 纖維密度大、絲束細長且連接緊實，纖維直徑在43.68～75.80 nm。通過對比可知，直徑大小為SH-03＞SH-01＞SH-02＞CZ-01。研究表明纖維以互相纏繞為結合方式的再造煙葉具有較好的松厚度，比橫縱交錯的結構更加均勻，從而能夠提高再造煙葉的品質［20］。3 種市售加熱卷煙再造煙葉纖維較粗，可能是由不同生產工藝或是解纖不完全導致，而BC 重組再造煙葉能夠有效將煙草基質與細菌纖維素結合，呈現出納米纖維獨特的超細網狀結構，使重組再造煙葉呈現均勻致密的空間結構。由于納米纖維的纖維直徑遠遠小于其他加熱卷煙專用再造煙葉，其參與重組再造煙葉后，BC 重組再造煙葉在20000倍電鏡下觀察仍然很少能夠看到空間縫隙。

圖5 不同放大倍數下再造煙葉纖維直徑Fig.5 Images of fiber diameter of reconstituted tobacco at different magnifications

2.5 熱性能分析

4 種再造煙葉的熱重曲線（TG）、微商熱重曲線（DTG）、差熱分析曲線（DSC）分別見圖6、圖7、圖8。將4種再造煙葉在加熱過程中的熱失重行為進行對比，總體上4種再造煙葉的熱失重均表現為明顯的4個階段。

圖6 4種再造煙葉熱重曲線TG圖Fig.6 Thermogravimetric curves of four reconstituted tobacco samples

圖7 4種再造煙葉微商熱重曲線DTG圖Fig.7 Derivative thermogravimetric curves of four reconstituted tobacco samples

圖8 4種再造煙葉差熱分析曲線DSC圖Fig.8 Differential thermal analysis curves of four reconstituted tobacco samples

階段Ⅰ：溫度區間55～125 ℃內相對失重為1.64%～4.60%。在80～100 ℃范圍內DTG圖出現1個較小極值峰，4種樣品隨溫度變化質量損失較小。由DSC圖可知，此階段出現1個吸熱峰，吸熱量為0.37～11.52 J?g-1，這是由于試樣中物質的熱分解或蒸發所致，表現為水分和揮發性物質的損失［21］。

階段Ⅱ：溫度區間130～260 ℃內相對失重為22.18%～29.66%。SH-03 的質量損失最大，為29.66%；SH-02 的質量損失最小，為22.18%。在200～230 ℃范圍內DTG 圖出現1 個寬峰，在DSC 圖上反映為1個較大的吸熱峰和1個較小的吸熱峰，總吸熱量為1.04～5.10 J?g-1，通常伴隨結晶融化、蒸發、升華等反應，主要表現為保潤劑失重［22］（丙二醇、甘油添加量為15%～20%），同時伴隨一些纖維素單糖晶體和小分子物質的熔融吸熱，SH-02 的失重峰較小，可能和甘油添加量較少有關。

階段Ⅲ：溫度區間280～400 ℃內相對失重26.63% ～33.25%；SH-02 質量損失最大，為33.25%，CZ-01的質量損失最小，為26.63%。階段Ⅱ、Ⅲ為主要失重階段，在DTG 圖中，階段Ⅲ的失重峰相對較尖銳，即質量損失最大。在DSC 圖上反映出1 個較大的放熱峰，放熱量為2.14～6.88 J?g-1，通常伴隨結晶形態轉變、氧化還原、化學分解等反應［23］，可能是由于碳骨架的斷裂引起的纖維素分解、高沸點化合物和小分子物質（煙堿、香味物質）的熱解，SH-01 的失重峰較大，推測其纖維含量較高。

階段Ⅳ：溫度400 ℃以上，質量損失趨于平穩且DTG圖中4種再造煙葉的峰形趨于平緩。在DSC圖上出現1個較小吸熱峰，吸熱量為0.15～0.73 J?g-1，說明溫度超過400 ℃時，大部分物質已經分解或釋放完畢，較小的失重可能是剩余未熱解物質的進一步裂解和碳化［24］。

對單位質量的總吸熱量進行比較，SH-01總吸熱量為4.05 J?g-1，SH-02總吸熱量為2.57 J?g-1，SH-03總吸熱量為8.51 J?g-1，CZ-01總吸熱量為9.52 J?g-1。表明細菌纖維素比植物纖維有著更強的吸熱和持熱能力，在溫度區間內熱反應更劇烈，有效傳遞的能量更多，有利于加熱過程中物質的穩定釋放。

2.6 化學成分分析

4 種再造煙葉水溶性總糖和煙堿含量（質量分數）見表2。由表2 可知，BC 重組再造煙葉（CZ-01）水溶性總糖和煙堿含量與市售再造煙葉相比處于較高水平，這是因為BC 重組再造煙葉（CZ-01）中添加了煙草浸提液發酵的細菌纖維素，纖維結構中附著的糖分和煙堿能夠轉移到再造煙葉中。通常再造煙葉的重要化學成分主要來源于選用的煙草原料和外源添加物質，受限于加工工藝。SH-01和SH-03造紙法再造煙葉受浸提流失和回涂率限制的影響，導致水溶性總糖和煙堿含量偏低。

表2 4種再造煙葉化學成分含量Tab.2 Contents of chemical components in four reconstituted tobacco samples

將4種再造煙葉在300～400 ℃下進行熱裂解，考察其香味物質釋放情況。由圖9可知，在此溫度段內4種再造煙葉的熱裂解產物中含有較多的醛酮類、醇類、酸類、雜環類物質，較少的酚類、酯類、烴類、內酯類等香氣前體物或致香成分，其中CZ-01 的香味物質種類最多，達45種，SH-03的種類最少，為38種。結合化學成分分析，BC重組再造煙葉相較于其他市售產品，總糖和煙堿的含量較高，香味物質一部分來自生物堿的熱解和轉化，如2，3'-聯吡啶等，對煙氣香味有明顯的提升作用，并對刺激性有抑制效果；一部分來自糖類物質的熱解，會生成呋喃類化合物（如2-乙酰基呋喃等），可增加堅果、烘烤、焦甜香韻［25］。

圖9 4種再造煙葉香味成分種類分布Fig.9 Types of aroma components in four reconstituted tobacco samples

4 種再造煙葉在300～400 ℃熱裂解出的香味物質見表3。由表3 可知，4 種再造煙葉的熱裂解釋放的香味成分各具特點。醛酮類化合物是影響煙草香味的重要物質，在CZ-01 中含量較高（14.23%～19.84%），SH-01 中含量較少（1.83%～7.94%）。熱解產物中雜環類化合物含量最多，占香味物質總含量的30%以上，其中煙堿在300～400 ℃內轉化和釋放較完全。統計再造煙葉中9種共有香氣物質的總量，即乙酸、羥基丙酮、糠醛、糠醇、苯乙醛、5-甲基呋喃醛、4，7，9-巨豆三烯-3-酮、4-羥基-β-二氫大馬酮和9-羥基-4，7-巨豆二烯-3-酮，在4 種再造煙葉的香味成分總量占比分別為35.03%、41.67%、40.36%、62.39%，此外CZ-01 還含有異丁醛、異戊醛、苯乙酸等煙草本源香味物質［26］，有利于提高BC重組再造煙葉的香氣水平。

表3 4種再造煙葉在300～400 ℃熱裂解釋放的香味物質Tab.3 Pyrolysis released aroma substances of four reconstituted tobacco samples at 300-400 ℃

表3 （續）

上述4 種再造煙葉的香味物質差異主要來源于不同的原料配方和工藝方法，造紙法再造煙葉的原料經浸提后內含物損失較多，回涂效果不理想，同時木漿纖維的引入還會帶來雜氣和苦味；稠漿法再造煙葉的香氣成分較依賴外源添加的香精香料且再造煙葉干燥時帶走大量水分，對香味物質的影響較大［4］；相對于市售產品，本研究中的CZ-01 并無外加香，其香味成分主要來源于BC 吸附的煙草發酵液，并且BC 纖維成分純度高，熱解時與香氣協調無雜氣，加之BC能夠吸收和釋放足夠的熱量促進煙草組織內部有效成分轉化，因此在一定程度上能夠說明該重組方式能夠有效富集、保留和釋放煙草香味物質，提高加熱卷煙熱源的利用效率，從而改善再造煙葉香氣水平，提高產品質量。

3 結論

以煙草浸提液為底物，通過生物發酵合成細菌纖維素，并利用剩余煙草原料，重組制成了一種適用于加熱卷煙的全煙草組分再造煙葉，通過對比分析，得到主要結論如下：①與3 種市售典型再造煙葉相比，BC 重組再造煙葉紅外吸收特征相似，具有類似的官能團結構；掃描電鏡顯示BC重組再造煙葉中的超細纖維使其組織結構更加均勻，在不使用外加木漿纖維和黏合劑的條件下，能夠保持較好的抗張強度。②BC重組再造煙葉熱解時，單位質量的總吸熱量最高，可為煙草材料穩定釋放內含物質提供足夠的能量。③BC 重組再造煙葉水溶性總糖含量為6.17%，煙堿含量達13.17 mg·g-1；熱裂解釋放的香味成分豐富，煙草本源香味物質種類多，特別是酮醛類致香物質釋放量明顯高于其他市售樣品。