副豬嗜血桿菌血清7型菌株毒力及耐藥性分析

王治方，徐引弟,朱文豪，張青嫻，焦文強，李海利，王克領

(河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，鄭州 450002)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,Hps)是一種革蘭氏陰性、形態多變、NAD依賴型細小桿菌，可長期寄生于豬的上呼吸道中，是當前規模化豬場主要的細菌性病原之一。當機體抵抗力降低時，可感染不同年齡、品種的豬，臨床上斷奶前后和保育仔豬發病率、死亡率較高，主要表現為多發性纖維素性漿膜炎、關節炎等病癥[1]。該病呈世界范圍內流行，每年給養豬行業帶來巨大的經濟損失。

Hps致病機制非常復雜，臨床可單獨感染發病，更多是作為繼發病原與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒、豬流感病毒等病原引發混合感染，加重病情和危害程度。其臨床血清型較多，已鑒定出15個血清型，還有20%左右的臨床菌株無法分型。Hps不同血清型的毒力及致病性存在較大差異，甚至同一血清型不同菌株的致病力也有一定差異，發病情況也不盡相同[2-3]。菌株毒力與其攜帶的毒力基因有密切關系。有資料表明，Hps血清1、5、10、13、14型為高毒力,2、4、15型為中等毒力,其他血清型劃分為無毒力[4-6]。但最近幾年，本實驗室在臨床典型病例中不斷分離出Hps血清7型菌株，證明Hps血清7型在臨床感染率越來越高。為了解河南地區Hps血清7型流行菌株的相似性、毒力和耐藥性，本研究以Hps血清7型參考菌株為對照，對6株Hps血清7型臨床菌株進行16S rRNA基因擴增、測序分析、毒力基因檢測、致病性試驗和藥敏試驗研究，以期為Hps血清7型的流行病學研究及臨床防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 6株Hps血清7型受試菌株由本實驗室臨床分離鑒定并保存，菌株信息見表1。Hps血清7型參考菌株，編號0007，由華中農業大學動物醫學院農業微生物國家重點實驗室惠贈。

表1 菌株信息

1.1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(碧迪醫療器械(上海)有限公司)；犢牛血清、50×TAE 濃縮液瓊脂糖和DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(輔酶Ⅰ，NAD)(Roche公司)；PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 Plus Dye)、DL2000 DNA Marker、DNA提取試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)；藥敏片(杭州濱河微生物試劑有限公司)。

Thermo 5020 PCR擴增儀、Thermo 1300SERIES A2生物安全柜(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；電泳儀(DYY-6型) (北京市六一儀器廠)；凝膠成像系統(沙船(天津)生物科技發展有限公司)；5418臺式高速離心機(Eppendorf公司)。

1.1.3 試驗動物 7周齡體重約250 g健康雄性豚鼠40只，購自鄭州大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 菌株DNA提取 將參考菌株和6株臨床菌株分別接種于TSA平板(含5%的犢牛血清，0.001% NAD)上，于37 ℃、5% CO2培養箱培養36 h，挑取典型菌落，按照DNA提取試劑盒說明書分別提取菌株的DNA，分裝備用。

1.2.2 菌株鑒定及序列分析 參照文獻[7-10]設計合成Hps 16S rRNA基因特異性引物和Hps血清7型引物，引物信息見表2。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。以提取的菌株DNA為模板，對受試菌株進行PCR擴增鑒定。PCR反應體系25 μL：2×PremixTaqTM13 μL，模板DNA 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性1 min，退火(退火溫度見表2)1 min，72 ℃延伸30 s，共40個循環；72 ℃延伸10 min。反應完成后，取10 μL PCR擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外成像系統觀察結果、拍照。

表2 Hps 16S rRNA及血清7型引物信息

將菌株16S rRNA基因PCR擴增產物送北京擎科生物科技有限公司測序,利用DNAStar、Mega 6.0軟件將菌株16S rRNA基因測序結果與GenBank數據庫中獲取的相近的參考菌株基因序列進行比對分析，構建系統進化樹。參考菌株信息見表3。

表3 參考菌株信息

續表

1.2.3 毒力基因檢測 參照文獻[11-13]合成副豬嗜血桿菌相關毒力基因的引物，引物信息見表4。以提取的菌株DNA為模板，進行菌株毒力基因PCR擴增檢測，鑒定菌株攜帶毒力基因情況。PCR反應體系25 μL：2×PremixTaq13 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，退火(退火溫度見表4)1 min，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min。反應完成后，取10 μL PCR擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外成像系統觀察結果、拍照。

表4 毒力基因引物信息

續表

1.2.4 致病性試驗 將40只試驗豚鼠隨機分為試驗組和對照組，試驗組7組，對照組1組，每組5只。挑選純化好的單個菌落接種于TSB(含5%的新生牛血清和0.001% NAD)液體培養基中，37 ℃振蕩培養24 h，計數備用。調整菌液濃度至2.0×109CFU/mL，試驗組豚鼠腹腔注射調整好的菌液0.5 mL/只；對照組豚鼠腹腔注射生理鹽水0.5 mL/只。接種后仔細觀察記錄每組發病情況，連續觀察10 d，對發病豚鼠進行細菌分離鑒定。

1.2.5 藥敏試驗 采用紙片擴散法對受試菌株和參考菌株進行藥敏試驗。將參考菌株和6株臨床菌株分別接種于TSA平板(含5%的犢牛血清，0.001% NAD)上，于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h，分別挑取各菌株的典型菌落，用滅菌PBS液制成濃度為0.5麥氏單位的菌懸液，用滅菌棉簽蘸取細菌懸液，均勻涂滿TSA平板(含5%的新生牛血清，0.001% NAD)表面；用滅菌鑷子夾取藥敏紙片均勻貼于TSA平板上，置于5% CO2培養箱37 ℃培養36 h，測量抑菌圈直徑大小，參照藥敏片說明書進行結果判定，包括敏感、中介和耐藥。

2 結 果

2.1 菌株鑒定和分型鑒定

PCR擴增結果顯示，參考菌株和6株臨床菌株均擴增出1 090和490 bp 2條條帶，大小和Hps、Hps血清7型目的條帶一致(圖1)，表明6株菌株均為Hps，血清型為7型。

M，DL2000 DNA Marker；1、2,菌株0007；3、4,菌株1436；5、6,菌株1437；7、8,菌株1532；9、10,菌株1565；11、12,菌株1624；13、14，菌株1678;15、16，陰性對照M，DL2000 DNA Marker；1 and 2,Strain 0007；3 and 4,Strain 1436；5 and 6,Strain 1437；7 and 8,Strain 1532；9 and 10,Strain 1565；11 and 12,Strain 1624；13 and 14，Strain 1678;15 and 16，Negative control圖1 菌株血清型PCR鑒定Fig.1 Identification of serotype of strains by PCR

利用Mega 6.0軟件，將受試菌株16S rRNA基因測序結果與GenBank數據庫中獲取的相近的基因序列進行比對分析，結果見圖2。由圖2可知，受試菌株與參考菌株0007核苷酸相似性在98.6%以上，與其他參考菌株核苷酸相似性在97.7%以上。菌株1436 與參考菌株0007核苷酸相似性最高，達100%；菌株1624與菌株1678核苷酸相似性最低，為97.7%。

圖2 菌株16S rRNA基因核苷酸序列相似性分析Fig.2 Similarity analysis of the 16S rRNA gene nucleotide sequence of strains

由16S rRNA基因序列的系統發育樹可知，菌株1624與其他菌株親緣關系較遠，單獨構成一個分支；菌株1436、1437、1532、1565、1678和參考菌株0007及參考菌株在同一個大分支中，菌株1436與參考菌株0007親緣關系最近；菌株1437、1532與參考菌株0007在一個小分支中，親緣關系較近；菌株1565和1678親緣關系較近，這2菌株分別與西班牙的CD7-3、CD8-1株親緣關系近(圖3)。說明，同一血清型不同菌株親緣關系存在一定差異性。

圖3 基于16S rRNA基因序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

2.2 毒力基因測定結果

通過毒力基因PCR擴增，臨床菌株和參考菌株檢測出了vta1、vta2、vta3、wza、nanH、ompP2、cdtA、cdtB、cdtC和espP2毒力基因(圖4)，其中臨床菌株1565和參考菌株0007毒力基因型一致，為vta1+vta2+vta3+wza+nanH+cdtA+cdtB+cdtC+espP2+；另外5株臨床菌株毒力基因型一致，為vta1+vta2+vta3+wza+ompP2+nanH+cdtA+cdtB+cdtC+espP2+(表5)。

M,DL2000 DNA Marker；1～13,capd、vta1、vta2、vta3、wza、hhdA、hhdB、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC和espP2基因M,DL2000 DNA Marker；1-13, capd,vta1,vta2,vta3,wza,hhdA,hhdB,ompP2,nanH,cdtA,cdtB,cdtC and espP2 genes,respectively圖4 毒力基因PCR檢測結果Fig.4 PCR results of virulence genes

表5 毒力基因檢測結果

2.3 致病性試驗結果

由表6可知，接種后，參考菌株0007組5只豚鼠均未表現任何臨床癥狀，生長狀態良好；1436株、1437株、1532株、1678株組均有1只出現被毛粗亂、反應遲鈍、蜷縮發抖等癥狀，未發生死亡。1565株、1624株組有2只出現癥狀，未發生死亡；生理鹽水對照組未出現任何癥狀；至試驗結束后對發病豚鼠剖檢，可見腹腔內有腹水、纖維素性滲出，程度不一。用心臟血液、肝臟觸片，革蘭氏染色鏡檢，均發現革蘭氏陰性、長短不一的細絲狀菌體。無菌采集試驗組發病豚鼠的心臟血液、肝臟接種TSA平板(含5%的新生牛血清，0.001%的NAD)，37 ℃培養30 h后，分離獲得和接種菌株相一致的單一細菌。

表6 致病性試驗結果

2.4 藥敏試驗結果

選用18種常用抗菌藥對參考菌株和受試菌株進行藥敏試驗，結果見表7。參考菌株和臨床菌株表現出不同的耐藥譜，均表現出多重耐藥。所有菌株對頭孢他啶和頭孢噻呋敏感性好，只有1株臨床菌株對頭孢噻呋表現為中介；對強力霉素、氟苯尼考、氧氟沙星、恩諾沙星敏感性較好,分別有1～3株表現為中介或耐藥；對青霉素、氨芐西林、阿莫西林、卡那霉素、紅霉素、土霉素、四環素、環丙沙星、諾氟沙星敏感性差，均有3株以上菌株表現為中介或耐藥；對新霉素、阿米卡星、替米考星敏感性最差，無菌株表現為敏感。

表7 藥敏試驗結果

3 討 論

副豬嗜血桿菌病是養豬行業的重要細菌性病原之一，可單一病原感染發病，更多是作為繼發病原感染豬群，引起混合感染，給養豬行業造成巨大經濟損失[14]。Hps臨床血清型較多，不同血清型菌株的毒力及致病性不同，臨床感染發病情況也不盡相同。河南地區主要流行菌株為4、5、13和7型[15]，4、5和13型相關報道也較多，而先前普遍認為血清7型菌株為無毒力菌株，相關報道較少。近年來，Hps血清7型在臨床病例中分離率明顯增多，可能與Hps血清7型菌株在臨床自然進化過程中菌株毒力增強有關。本試驗以Hps血清7型參考菌株為對照，對河南地區6株Hps血清7型臨床菌株進行分型鑒定、相似性分析、毒力基因、藥敏試驗及豚鼠致病性研究，與參考菌株相比，臨床菌株在毒力基因、耐藥表型方面均表型出一定的差異。分析可能是臨床菌株受自然環境和宿主體內某些變化影響，導致菌株在宿主體內感染過程中個別毒力基因表達出現上調或下調；同時由于國內抗生素使用不規范，同一血清型不同菌株在不同豬場受到抗生素選擇壓力差異較大，導致同一血清的不同菌株臨床耐藥表型出現一定的差異。

通過16S rRNA基因序列相似性比對及發育樹構建發現，6株Hps血清7型菌株與參考菌株相似性及親緣關系表現出有一定的差異性，其中菌株1436與參考菌株相似性達100%，親緣關系最近；菌株1624與參考菌株的相似性為98.6%，親緣關系相對較遠。這充分說明同一血清型同一地域分離的菌株也存在一定的差異性。

Hps的致病過程包括感染黏附、侵入宿主、逃避宿主的防御機制、在宿主體內繁殖并對組織產生損傷。該過程是菌體攜帶所有毒力基因協同參與的復雜過程，每個或每類毒力基因功能作用尚未研究清楚。本試驗篩選檢測的13個毒力基因是Hps的部分致病關鍵因子。capd基因編碼一種多糖合成蛋白，與菌體莢膜的生物學功能有關。vta1、vta2、vta3屬于三聚體自轉運蛋白，與病原體逃避宿主免疫系統監視密切關系[16-18]。wza是與Hps莢膜多糖輸出蛋白相關的基因，在菌株莢膜多糖轉運過程中起重要作用，與菌體黏附和抗吞噬方面有重要關聯。神經轉氨酶nanH基因與細菌的氧化耐受能力有關，在細菌感染宿主過程重要作用。hhdA、hhdB基因是溶血素修飾蛋白基因，主要參與溶血素的分泌與修飾[16-17]。cdtA、cdtB、cdtC是細胞膨脹毒素，誘導細胞膨脹、細胞核擴大并最終凋亡，是Hps菌株直接發揮細胞毒性的重要武器。ompP2是一種孔蛋白，在Hps外膜中含量最多，與細菌抗吞噬、抗補體介導的血清殺菌作用有關。胞外絲氨酸蛋白酶espP2基因屬于自轉運蛋白基因，與細菌的黏附、入侵和細胞毒性有關，可介導生物被膜形成和血清抗性的產生等[18]。6株Hps血清7型共檢測出2種毒力基因型，其中1株臨床菌株與參考菌株相同，為vta1+vta2+vta3+wza+nanH+cdtA+cdtB+cdtC+espP2+；另外5株臨床菌株毒力基因型相同，為vta1+vta2+vta3+wza+ompP2+nanH+cdtA+cdtB+cdtC+espP2+。該結果與張青嫻等[19]報道有一定差異。臨床菌株ompP2基因表達出現明顯上調，該基因主要與細菌抗吞噬、抗補體介導的血清殺菌有關，這可能與近年來Hps血清7型臨床分離率增多有一定關聯。6株臨床菌株均分離于典型病例，說明菌株具有一定的致病性；豚鼠致病性試驗也表明，6株臨床菌株均可感染豚鼠發病，發病率為20%～40%，但死亡率為0。與張青嫻等[20]報道Hps血清5型攜帶14個毒力基因，感染豚鼠發病率80%，死亡率40%比較，Hps血清7型對豚鼠有一定的致病性，但毒力明顯較弱，與陶偉杰等[21]試驗結果基本一致。毒力基因檢測結合致病性試驗，攜帶10種毒力基因的菌株與攜帶9種毒力基因的菌株相比，在致病性上沒有明顯差異，說明Hps的致病性不是毒力基因簡單的累加，而是多個毒力基因協同參與復雜的動態結果，除本次檢測的毒力基因外，可能還有其他毒力基因參與，同時細菌毒力基因在感染過程中啟動表達會有一定差異，致病表型也會出現差異。毒力表型與毒力基因型有一定的相關性，但不完全一致，致病機制十分復雜，需更多試驗進行深入研究。

抗生素仍是當前防控副豬嗜血桿菌病的有效途徑，但由于養殖過程中抗生素長期濫用或不規范使用，導致細菌耐藥性越來越嚴重，使得藥物抗菌效果越來越差。從藥敏試驗結果可看出，菌株1678與參考菌株0007耐藥譜相近外，其他菌株耐藥譜均有一定差異。總體來說，參考菌株和臨床菌株均對頭孢他啶和頭孢噻呋敏感性好，這與史開志等[22]報道結果較一致；而對青霉素、氨芐西林等β-內酰胺類藥物敏感性差，這與陶偉杰等[21]和田昊倫等[23]結果一致，而與Miani等[24]、鄧同煒等[25]報道結果不同；對氟苯尼考敏感性較好，這與田昊倫等[23]、Zhao等[26]結果一致。受試菌株對氨基糖苷類、大環內酯類敏感性最差。此外，參考菌株和臨床菌株均表現出耐3種以上藥物的多重耐藥現象。因此，生產實踐中對臨床分離菌株進行及時、準確的耐藥性檢測，篩選敏感藥物，對防治該病具有重要意義。

4 結 論

Hps血清7型臨床菌株和參考菌株表現出2種毒力基因型，臨床菌株較參考菌株毒力有一定的增強，可引起20%～40%豚鼠感染發病，表現一定的臨床癥狀，但不能致死豚鼠。臨床菌株和參考菌株均對頭孢他啶和頭孢噻呋敏感性好；對強力霉素、氟苯尼考敏感性較好；但對新霉素、阿米卡星、卡那霉素、紅霉素、替米考星耐藥性較強，且均表現明顯的多重耐藥現象。該研究為Hps血清7型流行病學、致病機制研究奠定了基礎，為Hps血清7型的臨床防控提供了參考依據。