miRNA-10 對人胰腺癌PANC-1 細胞生物學功能的影響及在胰腺癌中的表達

劉玉蘭，何鳳屏，黃從云，李定云

廣東省汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院檢驗科，廣東韶關 512025

胰腺癌（pancreatic cancer，PaCa）是消化系統的惡性腫瘤，其致死率極高[1]。國內外對胰腺癌研究明顯落后于肝、胃、腸道腫瘤，胰腺癌的5年生存率不足5%[2]。臨床常用血清標志物CEA、CA-199、CA-242 聯合檢測對胰腺癌診斷的靈敏度僅為30%~50%[3]。迫切需要尋找胰腺癌敏感性和特異性高的標志物是國內外研究的熱點。雖然miRNA-10 調控多種腫瘤的發生發展[4]，但其在調控胰腺癌細胞侵襲、轉移和誘導細胞凋亡目前未見有文獻報道。本研究通過選擇2017年3月—2019年9月在粵北人民醫院腫瘤中心肝膽外科手術治療的80例經病理診斷為胰腺癌患者為研究對象，研究miRNA-10 對PANC-1 細胞株生物學功能的影響，皆在為PaCa 的臨床診療提供新的思路和新靶點。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在本院病理診斷證實為PaCa 患者80例，其中男50例，女30例；年齡37~68歲，平均（57.91±5.36）歲。所有患者術前均未接受放射治療、化學藥物、免疫治療。根據美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer, AJCC）和國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control, UICC）胰腺癌TNM 分期標準[5]：Ⅰ期3例，Ⅱ期17例，Ⅲ期50例。另取同期健康體檢者80名作為對照，年齡45~65歲，平均（56.39±5.24）歲。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。所有研究對象簽約知情同意書，且通過汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院倫理委員會批準。

1.2 試劑及儀器

總RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR 試劑盒、PCR 引物購于上海生工生物工程股份有限公司，主要儀器采用美國BIO-RAD CFX96 實時熒光定量PCR 儀。

1.3 方法

1.3.1 集血漿標本所有研究對象均在入選次日清晨7：30 am 空腹，抽取靜脈血檢測常規腫瘤標志物，同時抽取5 mL 靜脈血置于乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid, EDTA）試管中，立即送到實驗室提取DNA或RNA，并放置于-80℃冰箱中保存備檢。

取胰腺癌組織及癌旁正常腸黏膜組織（距離腫瘤邊緣至少5~6 cm），離體10 min 內放入液氮保存，用于提取總RNA。

1.3.2 總RNA 提取血漿總RNA 的提取嚴格按照RNA 提取試劑說明書進行提取血漿總RNA。通過使用紫外分光光度儀測定所提取RNA 的濃度及純度，并計算RNA濃度。

1.3.3 逆轉錄PCR逆轉錄PCR 反應嚴格按照特異性反轉錄引物的說明書進行。

1.3.4 實時熒光定量PCR 技術采用實時熒光定量PCR 技術分別檢測各組miRNA-10 的表達，同時也檢測各細胞中PTEN mRNA 的表達情況，并作相關分析，以U6 為內參照，用2-△Ct 法計算目的基因的相對表達量。在BIO-RAD CFX96 實時熒光定量PCR 儀上進行熒光擴增和檢測其相對表達量。

1.3.5 細胞培養及轉染采用消化法培養將人胰腺癌細胞株PANC-1，分為兩組：一組加入胰腺癌細胞，另一種為正常胰腺細胞，分別加入miRNA-10 誘導培養的細胞生長，培養24 h 后觀察兩組細胞生長情況。

采用Transwell 細胞侵襲實驗和MTT 法分別檢測miRNA-10 轉染組和對照組的侵襲能力，評估miRNA-10 調控PTEN 促PaCa 細胞的生長、增殖、侵襲和遷移作用。

細胞轉染實驗：選擇合適的混合比例（1∶1-1∶2/脂質體體積：DNA 質量）來轉染PANC-1 細胞。

Transwell 細胞侵襲實驗：PANC-1 細胞經無血清培養后6 h，消化、計數，吹打至1×105個/mL。取500 μL 細胞懸液加入Transwell 小室中，下室加入1 mL 培養基；培養后24 h 計算下室細胞數，每組設3 復孔，取平均值。

1.4 預測miRNA-10 靶基因

采用TargetScan 6.2、miRDB 和PicTar 生物信息軟件預測miRNA-10 靶基因，初步認為PTEN 基因是miRNA-10 靶基因

1.5 流式細胞術（flow cytometry,FCM）法檢測細胞凋亡

根據實驗要求誘導細胞凋亡，制備miRNA-10 mimics 結合重懸細胞的單細胞懸液，使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，通過Annexin V 抗體與磷脂絲氨酸（phospholipid serine, PS）的特異性結合來檢測細胞凋亡情況。

1.6 FCM 法檢測細胞周期變化

收集對數生長期細胞接種于6 孔培養板中，加入不同濃度miRNA-10 mimics，離心收集細胞，上流式細胞儀進行檢測DNA 周期變化。

1.7 觀察指標

①觀察miRNA-10 在胰腺癌患者血漿和組織中的表達水平；②觀察miRNA-10 在胰腺癌細胞株中的表達水平；③觀察胰腺癌細胞系中miRNA-10 與PTEN 的 關 系；④miRNA-10 過 表 達對PANC-1 細胞生長的影響；⑤miRNA-10 過表達對PANC-1 細胞增殖的影響；⑥miRNA-10 mimics過表達對PANC-1 細胞遷移的影響。

1.8 統計方法

采用SPSS 24.0 統計學軟件分析數據，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗；計數資料以頻數或率（%）表示，組間差異比較采用χ2檢驗，采用Spearman 分析CRC 患者血清miRNA-10 與PTEN 表達水平的相關性。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-10 在胰腺癌患者血漿和組織中表達分析

在胰腺癌患者血漿和組織中miRNA- 10 明顯增高，分 別 為（3.56±1.43）和（4.28±1.57），對 照 組 為（0.43±0.27），經比較，差異有統計學意義（P<0.01），分析兩者呈正相關（r=0.943，P<0.01）。

2.2 miRNA-10 在胰腺癌細胞株中的表達分析

提取10例胰腺切緣處無腫瘤病灶正常黏膜組織PANC-1 細胞，分析轉染miRNA-10 mimics 后的miRNA-10 的表達，轉染miRNA-10 mimics 后的miRNA-10 的表達水平是陰性與對照組的5 000 倍，差異有統計學意義（P<0.001）。

2.3 胰腺癌細胞系中miRNA-10 與PTEN 的關系分析

在數據庫TargetScan 6.2、miRDB 和PicTar 等初步選定PTEN 為miRNA-10 的靶基因，通過采用實時熒光定量PCR 檢測胰腺癌PANC-1 細胞中miRNA-10 與PTEN的表達水平分析兩者的相關性，兩者表達呈負相關（r=-0.916，P<0.01）。

2.4 miRNA-10 過表達對PANC-1 細胞的影響分析

MTT 實驗結果顯示，細胞轉染的miRNA-10 mimics組 分 別12、24、36、48 和60 h 的 相 對 表 達 量 分 別 為（11.8±1.87）、（17.34±2.23）、（23.17±2.36）、（31.56±3.11），均高于陰性與對照組（4.96±1.13），差異有統計學意義（P<0.001），miRNA-10 過表達對PANC-1 細胞的生長具有明顯的加速作用。

2.5 miRNA-10 過表達對PANC-1 細胞增殖的影響分析

平板克隆形成實驗分析miRNA-10 mimics 轉染2 周后細胞克隆數為（380±84）個，明顯高于陰性與對照組（140±17）個，差異有統計學意義（P<0.01），miRNA-10過表達對PANC-1 細胞的增殖具有明顯促進的影響。

2.6 miRNA-10 mimics 過表達對PANC-1 細胞遷移的影響

Transwell 實驗檢測結果顯示，miRNA-10 mimics 轉染2 周后，觀察到PANC-1 細胞遷移能力的變化，在miRNA-10 mimic 組（321.43±17.34）明 顯 快 于 對 照 組（85.43±11.67），差異有統計學意義（P<0.05），見圖1。圖1 表示Transwell 實驗在轉染miRNA-10 mimics 后對PANC-1 細胞遷移能力的影響，在加入miRNA-10 mimics 后顯示細胞遷移能力明顯加快，與對照組比較，差異有統計學意義（***P<0.001）。

圖1 miRNA-10 mimics 對細胞遷移能力的影響Figure 1 The effect of miRNA-10 mimics on cell migration ability

2.7 miRNA-10 inhibitor 對PANC-1 細胞凋亡率的影響分析

miRNA-10 inhibitor 轉染PANC-1 細胞48 后，FCM 法檢測結果顯示，陰性對照組和miRNA-10 inhibitor 組細胞凋亡率分別為（14.87±1.51）%和（33.66±2.95）%，細胞凋亡率在陰性對照組明顯低于miRNA-10 inhibitor 組，差異有統計學意義（P<0.01），見圖2。圖2 表示miRNA-10 inhibitor 對PANC-1 細胞凋亡率的影響，在轉染miRNA-10 inhibitor 后顯示細胞凋亡率增加，與對照組比較，差異有統計學意義（**P<0.01）。

圖2 miRNA-10 inhibitor 對PANC-1 細胞凋亡率的影響Figure 2 The effect of miRNA-10 inhibitor on the apoptosis rate of PANC-1 cells

2.8 miRNA-10 inhibitor 對PANC-1 細胞周期各時期影響分析

FCM 法檢測結果顯示，陰性對照組與miRNA-10 inhibitor 組在G1 期、S 期和G2 期細胞所占比例分（36.60%vs 27.48%）、（45.67% vs 53.06%）、（17.73% vs 19.46%），兩組比較，miRNA-10 inhibitor 組G1 期細胞所占比例明顯減少，S 期細胞所占比例明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01），見圖3A、圖3B。miRNA-10 inhibitor 組誘導PANC-1 細胞在G1/S 期增殖，顯示miRNA-10 表達下調對細胞周期分布的影響，差異無統計學意義（P>0.01）。

3 討論

研究發現，miRNA-10 的表達與肺癌、肝癌等惡性腫瘤的發病有密切關系[5]，在調控腫瘤細胞侵襲和遷移這一方面起重要作用。實驗發現miRNA-10 在PaCa 患者血漿中水平升高，腫瘤切除后水平明顯下降。近期研究顯示，miRNA-10 在細胞株和PaCa 患者組織呈高表達水平，并與患者生存率呈反比，認為miRNA-10 與PaCa的侵襲力密切相關[6]。本研究采用實時熒光定量PCR技術檢測CRC 患者血漿和組織中miRNA-10 的表達明顯上調，并發現血漿miRNA-10 與PaCa 病理分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關，隨著腫瘤惡性度的升高，miRNA-10 表達逐步增高，尤其在TⅢ、TⅣ期間的增高特別明顯，各組間差異有統計學意義（P<0.05；P<0.01）。

目前，有多項研究表明，miRNA-10 作為促癌因子促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移，并誘導細胞凋亡，調控腫瘤細胞進入細胞生長時期（S 期）。AguennouzM 等[7]報道miRNA-10 在各種類型神經膠質瘤中均表達上調，并與多病灶腫瘤及擴散有密切關聯，提示促進腫瘤細胞的侵襲和轉移；在另一些腫瘤組織表達為下調[8]。本文顯示轉染miRNA-10 mimics 后的胰腺癌PANC-1 細胞克隆數目明顯增加，細胞生長加快，表明miRNA-10 可以促進胰腺癌細胞的增殖。在FCM 法檢測時觀察到，下調miRNA-10 表達后，PANC-1 細胞凋亡率顯著提高。本研究認為，miRNA-10 誘導胰腺癌細胞的侵襲和轉移可能通過影響胰腺癌細胞的增殖和凋亡的機制。

PTEN 基因主要通過細胞凋亡、細胞周期、細胞增殖和遷移等環節發揮抑癌功能。本研究中，通過轉染miRNA-10 inhibitor 發現胰腺癌PANC-1 細胞中miRNA-10 的表達下調，發現下調miRNA-10 能刺激PTEN 表達上調。本研究組推測miRNAs可能通過下調PTEN通路抑制PaCa 細胞增殖和誘導細胞凋亡。PTEN 是腫瘤抑制基因，具有脂質和蛋白雙重磷酸活性，在細胞生長、增殖、凋亡、血管生成、細胞侵襲和遷移等方面起到重要作用[9]。本研究初步在PaCa細胞中檢測miRNA-10和PTEN的表達水平，隨著miRNA-10 表達的增加，PTEN 基因表達下調，提示在PaCa 中miRNA-10 和PTEN 可能存在特殊的相互作用。

綜上所述，miRNA-10 可以促進PaCa 細胞的增殖和調控細胞凋亡過程，提示miR-10-PTEN 通路可能作為未來潛在的PaCa 抗癌細胞侵襲和轉移療法的新靶點，另一方面也可以作為臨床診斷和預后評價的新分子標志物。