UPLC-MS/MS直接進樣法測定茶飲料中的吡蟲啉和樂果殘留

呂志強，周文禮

許昌市食品藥品檢驗檢測中心，河南 許昌 461000

“開門七件事，柴米油鹽醬醋茶”，茶既是大雅之堂的殿上貢品，亦是尋常百姓的餐桌飲品。然而，茶作為一種農產品，在種植過程中為防治蟲害，提高產量，不免使用多種農藥；同時，頗受消費者青睞的茶飲料作為茶葉的深加工產品，一般以茶葉的水提取液、濃縮液或茶粉為原料加工而成，因此，農藥殘留是一個不可避免的問題。殘留的農藥通過食物鏈的富集作用轉移到人體，對人體健康造成危害，因此，研究建立茶飲料中農藥殘留的檢測方法十分必要。

農殘的檢測方法主要有氣質聯用技術（GCMS/MS） 和液質聯用技術（LC-MS/MS）。GC-MS/MS 因分離效果好，對組分復雜的樣品能夠實現有效分離，因此廣泛應用于農殘檢測領域，但其對樣品前處理要求較高，分析時間較長，效率低；而LC-MS/MS 具有靈敏度高，專屬性強，高通量，效率高，在分離不完全的狀態下也可以實現對目標分析物的定性定量等特點。目前，應用LC-MS/MS 測定茶飲料中農殘的研究鮮有報道，而對茶葉中農殘的研究有較多文獻報道，且其前處理方法為固相萃取法、液-液萃取法和QuEChERs 法等，這些前處理方法使用了多種有機試劑，成本高、耗時長、操作繁瑣。因吡蟲啉和樂果為茶園中比較常用的農藥，在茶湯中的浸出率也較高，分別可達77.3%和80.5%，故本研究以吡蟲啉和樂果為分析目標物，旨在運用UPLC-MS/MS，并嘗試將樣品過濾后直接進樣檢測，研究建立一種便捷、準確、高效、經濟的適用于茶飲料中吡蟲啉和樂果殘留的檢測方法，以期為茶飲料的質量安全評價提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

UPLC-MS/MS（美國，Waters，UPLC-Xevo TQD)；UPT-I-510T超純水機（成都優普）；NGM-2000A氮氣發生器（北京，LAB PRECITION）。

1.2 試劑與材料

甲醇（德國AppliChem，色譜純)；乙腈（德國AppliChem，色譜純)；甲酸（天津科密歐，色譜純）；超純水（由UPT-I-510T 超純水機制備）；高純氬氣（純度≥99.999%）；微孔濾膜（尼龍，0.22μm）；吡蟲啉、樂果標準溶液（壇墨質檢，質量濃度均為100μg/mL）；經檢測不含樂果、吡蟲啉的市售綠茶飲料（GT樣）、紅茶飲料（BT樣）。

1.3 試驗方法

精密量取吡蟲啉、樂果標準溶液各1.00 mL置100 mL容量瓶中，加乙腈稀釋定容，搖勻即得質量濃度為1 000μg/L混標I，分別用GT樣和BT樣將混標I逐級稀釋得到質量濃度分別為2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L的系列基質標準工作溶液。

質譜調諧液：用純乙腈將混標I 稀釋至100 μg/L。

稀釋劑考察樣品：分別用超純水、10%乙腈、50%乙腈、乙腈、GT樣和BT樣將混標I稀釋至50μg/L。

直接進樣法可行性考察樣品：用BT樣將混標I 稀釋至100μg/L（BT 樣#）；再用乙腈將BT 樣#分別稀釋至10μg/L、20μg/L、50μg/L。

基質效應評價樣品：分別用10%乙腈、GT 樣和BT 樣將混標I 分別稀釋至5 μg/L、50 μg/L、200μg/L。

方法檢出限（MDL）和方法定量限（MQL）樣品：分別用GT 樣和BT 樣將混標I 逐級稀釋，具體稀釋倍數根據信噪比（S/N）確定，以S/N≥3時的質量濃度作為MDL，以S/N≥10 時的質量濃度作為MQL。

加標回收率樣品：分別用GT 樣和BT 樣將混標I 分別稀釋至10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L，每個質量濃度水平設3個平行樣。

流動相：A 為含0.1%甲酸的超純水，B 為乙腈，梯度洗脫程序：0～1.5 min，70.0%A；1.5～3.5 min，10.0%A；3.5～4.5 min，10.0%A；4.5～4.6 min，70.0%A；4.6～6.0 min，70.0%A；流速0.250 mL/min；柱溫35.0 ℃；色譜柱：UHPAQ C（Agela Technologies，2.1 mm×100.0 mm，1.9 μm）；進樣量：5.00 μL。

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描模式；檢測方式：多反應監測模式（MRM）；毛細管電壓：3.5 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：500 ℃；脫溶劑氣氮氣流速：1 000 L/h；碰撞氣為氬氣；目標分析物的其他質譜采集參數見表1。

將上述樣品經0.22 μm 濾膜過濾后直接導入UPLC-MS/MS 測定，由MssLynx 工作站軟件分析數據，繪制標準曲線，計算樣品中各農殘的含量。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

吸取1.3.2 項下的質譜調諧液適量，在combined 模式下與流動相（A∶B=50∶50，流速0.200 mL/min）混合后注入質譜儀，通過調整毛細管電壓、錐孔電壓找到母離子，運用Intellistart自動優化功能，得到最優的錐孔電壓和碰撞能，確定定性離子對和定量離子對（表1）。

表1 質譜參數

2.2 稀釋劑的選擇

研究發現，稀釋劑對目標分析物的峰型和分離度影響較大。當稀釋劑為乙腈時，吡蟲啉和樂果未能有效分離且不成峰，當提高稀釋劑中水相的比例時，其峰型不僅變得尖銳，對稱性良好，且分離度也有了很大改善。因此，本研究分別以乙腈、50%乙腈、10%乙腈、超純水、BT樣和GT樣為稀釋劑制備50μg/L標準工作溶液進行考察，結果發現，以10%乙腈、純水、GT 樣和BT 樣為稀釋劑時，均可得到較為滿意的結果（圖1）。

圖1 6種稀釋劑制備的50μg/L標準工作溶液的總離子流圖

2.3 色譜條件的優化

以0.1%甲酸為流動相A，乙腈為流動相B 梯度洗脫，考察了3 種色譜柱（ACQUITY UPLCBEH C，1.7 μm，2.1×50 mm；ACQUITY UPLCBEH C，1.7 μm，2.1×100.0 mm；UHP AQ C，1.9 μm，2.1 mm×100.0 mm），不同流動相初始比例（A∶B=90∶10；A∶B=80∶20；A∶B=70∶30；A∶B=50∶50）和不同流速（0.200 mL/min、0.250 mL/min、0.300 mL/min）對分析結果的影響。通過多次反復試驗，最終確定色譜柱UHP AQ C，1.9 μm，2.1 mm×100.0 mm的適用性最優，流速為0.250 mL/min，流動相初始比例為A∶B=70∶30，在此色譜條件下系統壓力適中。由圖2可知，目標分析物的峰型尖銳，分離度較好，保留時間適中，吡蟲啉和樂果保留時間分別為2.03 min和2.25 min。

圖2 100μg/L標準工作溶液的總離子流圖

2.4 直接進樣法可行性試驗

目前，未見有文獻報道運用UPLC-MS/MS 直接進樣法測定茶飲料中的吡蟲啉和樂果，為驗證該方法的可行性，本研究將1.3.2 項下的直接進樣法可行性考察樣品經0.22μm濾膜過濾后直接進樣測定，以目標分析物檢測結果的準確度為評判依據，結果見表2。由測定結果可知，茶飲料樣品經濾膜過濾后稀釋不同倍數直接進樣所測結果的準確度在95.5%～107.0%之間，故直接進樣法是可行的。

表2 直接進樣法測定結果

2.5 基質效應評價[28-29]

因茶湯本身基質復雜，含有多種色素、茶多酚、咖啡堿、有機酸等物質，且茶飲料中會添加糖、食用香精等成分，這些成分是否影響目標分析物的離子響應強度及分析方法的準確性還是未知，因此，本研究考察了吡蟲啉和樂果3個質量濃度水平在GT和BT兩種基質中的基質效應。以絕對基質效應（AME）為評判依據，計算公式如下：

式中：為基質標準工作溶液峰面積；為溶劑標準工作溶液峰面積；當|AME-1|≤20%時，判定該基質無基質效應；若20%＜|AME-1|＜50%，則為中等基質效應；|AME-1|≥50%，則為強基質效應。由表3可知，吡蟲啉在BT 基質中有較強的基質效應，而在GT 基質中無基質效應；樂果在GT 和BT 基質中均無基質效應。為消除基質效應的影響，在配置標準曲線工作溶液時統一選擇空白的GT樣和BT樣為稀釋劑。

表3 基質效應評價結果

2.6 線性范圍、MDL、MQL

按照1.3.1 項下的方法制備系列基質混合標準工作溶液，以各目標分析物的峰面積為縱坐標，相應的質量濃度為橫坐標，考察其線性關系，以S/N≥3 和10 時對應的質量濃度為MDL 和MQL，結果見表4。

表4 標準曲線回歸方程

兩種基質下吡蟲啉和樂果在2～500μg/L范圍內線性關系良好，R為0.996 5～0.999 5，MDL為0.010 0～0.033 3μg/L，MQL為0.020 0～0.100 0μg/L，表明該方法可滿足檢測需求。

2.7 方法精密度

將質量濃度為50μg/L的基質混合標準工作溶液重復測定6 次，計算檢測結果相對標準偏差（RSD）。由表5可見，兩種基質下吡蟲啉和樂果測定值的RSD在0.937%～2.020%之間，表明該方法精密度良好。

表5 方法精密度試驗結果

2.8 方法準確度

將1.3.4項下制備好的加標回收率樣品過0.22μm濾膜后直接進樣測定，每個質量濃度水平設3個平行樣，計算平均回收率及RSD。由表6可知，2種基質3個添加水平下吡蟲啉和樂果的平均加標回收率在93.3%～111.0%之間，RSD 在0.564%～6.190%之間，可滿足分析要求。

表6 加標回收率試驗結果

3 結論

本研究嘗試采用將茶飲料經0.22μm濾膜過濾后直接進樣檢測的前處理方法，結合UPLC-MS/MS技術，建立了茶飲料中吡蟲啉和樂果快速、準確的檢測方法，這在現有文獻中還未見報道。通過評價基質效應確定以基質匹配標準工作曲線法定量，并對質譜條件、液相色譜條件、稀釋劑等進行了優化。研究結果表明，在綠茶和紅茶兩種基質中，吡蟲啉和樂果在2～500μg/L范圍內線性關系良好，相關系數R為0.996 5～0.999 5；MDL為0.010 0～0.033 3μg/L，MQL為0.020 0～0.100 0μg/L；方法精密度良好，RSD （n=6） 在0.937%～2.020%之間；3個質量濃度添加水平下吡蟲啉和樂果的平均加標回收率在93.3%～111.0%之間，RSD（n=3）在0.564%～6.190%之間，能夠滿足農殘檢測的要求。與現有國家標準和文獻報道的方法相比較，該方法避免使用多種有機試劑，成本低、簡便高效、精密度好、準確度高，適用于茶飲料中吡蟲啉和樂果殘留的定性定量分析，為茶飲料的質量安全評價提供了新的參考。