枳椇子抗肝纖維化作用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

吾斯曼·艾海提，艾則孜江·艾爾肯

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830054）

肝纖維化是因肝臟受到長(zhǎng)期刺激時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)分泌過(guò)多沉積導(dǎo)致，是慢性肝炎- 肝纖維化- 肝硬化發(fā)展過(guò)程中的重要中間環(huán)節(jié)［1-2］。肝病在我國(guó)的發(fā)病率呈持續(xù)升高趨勢(shì)，其中慢性肝炎進(jìn)展為肝硬化的發(fā)生率為2%～10%［3］。目前，有研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化可逆，但臨床尚無(wú)有效的治療藥物與方法［4］。近年來(lái)，中醫(yī)藥在抗肝纖維中顯示出顯著優(yōu)勢(shì)［5］。枳椇子為鼠李科植物北枳椇Hovenia dulcisThunb. 的干燥成熟種子，始載于《新修本草》，具有止渴除煩、清熱利尿之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，枳椇子可改善模型大鼠肝纖維化程度［6-7］。其能改善肝功能，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1（TIMP- 1）的表達(dá)，進(jìn)而改善肝臟膠原的降解功能，逆轉(zhuǎn)肝纖維化［8-9］，但枳椇子抗肝纖維化的有效活性物質(zhì)及作用機(jī)制尚待闡明。因此，本研究中基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過(guò)預(yù)測(cè)分析枳椇子的活性成分及其治療肝纖維化的靶點(diǎn)、信號(hào)通路，探討其抗肝纖維化的作用機(jī)制，以期為臨床防治肝纖維化提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 活性成分及靶點(diǎn)獲取

以枳椇子為關(guān)鍵詞輸入中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（TCMSP），設(shè)口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，檢索枳椇子的活性成分，并獲取成分靶點(diǎn)，同時(shí)借助蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Uniprot，https：//www.uniprot.org）標(biāo)準(zhǔn)化處理成分靶點(diǎn)。

1.2 肝纖維化靶點(diǎn)獲取

以“hepatic fibrosis”為關(guān)鍵詞，分別輸入GeneCards、人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，http：//www.omim.org）及疾病關(guān)聯(lián)關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)（DisGeNET，https：// www. disgenet.org），檢索肝纖維化的靶點(diǎn)并合并，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后即得肝纖維化潛在靶點(diǎn)。

1.3 抗肝纖維化靶點(diǎn)獲取及成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的成分靶點(diǎn)及肝纖維化靶點(diǎn)輸入Venny 平臺(tái)，取交集，即得枳椇子抗肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。將枳椇子活性成分及枳椇子抗肝纖維化的潛在靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 軟件中，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并借助軟件分析工具對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，節(jié)點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)度（Degree）值越大，代表節(jié)點(diǎn)越重要，最后根據(jù)Degree值排序篩選靠前的成分為核心成分。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將枳椇子抗肝纖維化的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)置物種為Homo sapiens，最小交互打分值為0.7，隱藏離散的蛋白，得到PPI 關(guān)系。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并借助軟件分析工具對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，根據(jù)Degree 值篩選靠前的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。

1.5 潛在靶點(diǎn)富集分析

利用R 語(yǔ)言軟件對(duì)枳椇子抗肝纖維化的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，其中GO 富集分析包括生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）及分子功能（MF）3個(gè)部分。根據(jù)P值篩選靠前的結(jié)果進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及靶點(diǎn)

共得活性成分7 個(gè)（見(jiàn)表1），靶點(diǎn)289 個(gè)，剔除重復(fù)及無(wú)標(biāo)準(zhǔn)名靶點(diǎn)后得187個(gè)靶點(diǎn)。

表1 枳椇子的活性成分Tab.1 Active components of Hovenia dulcis

2.2 肝纖維化潛在靶點(diǎn)

在 GeneCards，OMIM 及 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)分別檢索得到6 241，28，63 個(gè)肝纖維化靶點(diǎn)，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后再與上述枳椇子活性成分及靶點(diǎn)取交集，得到枳椇子抗肝纖維化的靶點(diǎn)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 活性成分-肝纖維化靶點(diǎn)維恩圖Fig.1 Venn diagram of active component-hepatic fibrosis targets

2.3 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

成分- 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)包含172 個(gè)節(jié)點(diǎn)，258 條邊，詳見(jiàn)圖2，圖中紅色為枳椇子活性成分，綠色為其抗肝纖維化潛在靶點(diǎn)。表明山柰酚、柚皮素、槲皮素等6個(gè)黃酮類化合物為參與抗纖維化過(guò)程的核心成分，其在抗肝纖維化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。

圖2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Active component-target network

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)

網(wǎng)絡(luò)中包含152 個(gè)節(jié)點(diǎn)，892 條邊，其中節(jié)點(diǎn)越大，藍(lán)色越深，代表其Degree 值越大，連線越粗代表蛋白間的相互作用越強(qiáng)，詳見(jiàn)圖3。根據(jù)Degree 值得到AKT1，JUN及MAPK3等10個(gè)靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，詳見(jiàn)表2。

圖3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network

表2 核心靶點(diǎn)信息Tab.2 Information of key targets

2.5 富集分析

GO 功能富集分析結(jié)果涉及對(duì)金屬離子的應(yīng)答、對(duì)脂多糖的應(yīng)答、藥物應(yīng)答、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的應(yīng)答、細(xì)胞對(duì)化學(xué)壓力的反應(yīng)等1 877條BP通路（圖4 A）；膜筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜筏、小窩及細(xì)胞器外膜等64個(gè)CC通路（圖4 B）；核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及G 蛋白偶聯(lián)受體活性等163 條MF 通路（圖4 C）。KEGG 富集分析結(jié)果主要涉及腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素17（IL-17）及晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE）等177條通路（圖4 D）。

圖4 富集分析結(jié)果Fig.4 Results of the enrichment analysis

3 討論

肝纖維化為慢性疾病，長(zhǎng)期刺激可使肝臟結(jié)構(gòu)改變甚至導(dǎo)致肝功能喪失，多種細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在肝纖維的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要［10］。中醫(yī)學(xué)中根據(jù)肝纖維化的病理特征，將其歸屬于“積聚”“脅痛”等范疇［3］。枳椇子可促進(jìn)肝星狀細(xì)胞（HSC）凋亡，減少ECM 的過(guò)量堆積，并減少轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）及TIMP-1的表達(dá)，進(jìn)而阻滯肝纖維化的發(fā)展［11］。本研究中通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，枳椇子主要通過(guò)β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素及柚皮素等活性成分發(fā)揮療效。β-谷甾醇能下調(diào)活化HSC 中膠原-1 和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）mRNA 的蛋白表達(dá)水平，防止膠原積累，從而治療肝纖維化［12］。山柰酚在體內(nèi)外均能顯著抑制膠原的合成和HSC 的活化，顯著降低肝組織壞死炎癥的評(píng)分，抑制激活素受體樣激酶5 而減輕肝纖維化［13］；其通過(guò)降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的活性，減少羥脯氨酸（HYP）的含量及炎性因子水平，進(jìn)而阻止肝纖維化進(jìn)展，保護(hù)肝組織，這可能與山柰酚抑制β-catenin的表達(dá)從而抑制β -catenin/Wnt 通路有關(guān)［14-15］。柚皮素可通過(guò)阻斷氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)以及TGF-β-Smad 3和JNK-Smad 3通路，滅活HSC和抑制促纖維化途徑減輕肝纖維化［16］。此外，柚皮素可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬改善四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的大鼠肝損傷［17］。

GO 及KEGG 富集分析結(jié)果顯示，枳椇子通過(guò)對(duì)金屬離子、脂多糖、藥物及細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程，涉及 AKT1、JUN 及 MAPK3 等核心靶點(diǎn)，調(diào)控TNF、IL-17 及AGE-RAGE 等通路發(fā)揮抗肝纖維化作用。通過(guò)下調(diào)AKT1 及p - AKT1 的表達(dá)，能抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活化，進(jìn)而促進(jìn)HSC 凋亡起保護(hù)肝纖維化作用［18］。c - Jun 是AP1 激活蛋白（AP1）的一個(gè)組成部分，其可被PI3K/AKT 信號(hào)通路激活，從而參與HSC的活化和肝纖維化［19］。通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Akt信號(hào)通路的磷酸化而抑制LPS 誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)大鼠免受肝軸異常引起的肝纖維化［20］。此外，通過(guò)下調(diào)MAPK，P-MAPK，P38 的蛋白表達(dá)水平，抑制MAPK 信號(hào)通路，可顯著改善CCl4誘導(dǎo)的纖維化［21］。TNF 為一種免疫細(xì)胞因子，參與機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)。通過(guò)降低TNF- α 和IL-1β 的表達(dá)水平，能抑制HSC 增殖及活化，減少ECM 的生成，增加其降解，進(jìn)而改善肝纖維化［22］。IL-17作為炎性細(xì)胞因子，在各種肝臟疾病中起重要作用，可調(diào)節(jié)HSC 的活化和肝纖維化進(jìn)展。3型細(xì)胞因子IL-17及IL-22可增強(qiáng)p38絲裂原激活蛋白激酶依賴的TGF-β 信號(hào)通路，進(jìn)而參與肝纖維化［23］。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）受體（RAGE）阻斷抗體及可溶性RAGE，可抑制AGE-RAGE 信號(hào)通路。RAGE 可降低AGE 誘導(dǎo)的HSC 的自噬和活化，進(jìn)而促進(jìn)丙型肝炎相關(guān)肝纖維化的形成，提示阻斷AGE -RAGE 信號(hào)可緩解肝纖維化［24］。本研究中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果與目前相關(guān)研究結(jié)果一致，提示枳椇子通過(guò)AKT1，JUN，MAPK3 調(diào)控TNF，IL - 17，AGE - RAGE 信號(hào)通路發(fā)揮抗肝纖維化作用。

綜上所述，枳椇子抗肝纖維化是通過(guò)β- 谷甾醇、山柰酚、槲皮素及柚皮素等活性成分作用于AKT1，JUN及MAPK3等核心靶點(diǎn)，調(diào)控TNF，IL-17，AGE-RAGE信號(hào)通路參與到抗肝纖維化進(jìn)程中。