熊去氧膽酸對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究

尤梅桂 田 華 曾 云

1.廈門醫學院基礎醫學部藥理教研室，福建廈門 361023；2.機能與臨床轉化福建省高等學校重點實驗室，福建廈門 361023

腦卒中是我國成年人致死、致殘的首位病因，具有發病率、致殘率、致死率和復發率高的性質[1]。最常見的腦卒中類型是急性缺血性腦卒中，占我國腦卒中的70%左右[2]。缺血性腦卒中已成為全球范圍內的嚴重問題[3]。目前，缺血性腦卒中的主要治療手段是溶栓治療[4]，針對缺血性腦卒中引起的神經功能性損傷尚無有效的治療手段，溶栓治療的患者當血流再次灌注可能發生腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI），因此尋找安全有效的治療藥物具有重要意義。目前有許多相關藥物主要包括腫瘤壞死因子-α、轉化生長因子-β1、煙酸、二硫氨基甲酸肽吡咯烷、二甲胺四環素、尿酸、他汀類及各種中成藥等，其主要是抗炎、抗氧化、血管內皮保護、抑制基質金屬蛋白酶活性及促進細胞外基質形成等，雖然這些措施有一定效果，但大部分仍在實驗階段或其療效有待于進一步臨床驗證[5-7]。熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是名貴中藥熊膽中主要有效成分之一，具有抗氧化應激、抗炎、抗凋亡、降低鈣離子溶度等作用，保護CIRI[8-12]。近年來，研究發現藥物可能通過磷酸化激活PI3K/AKT 信號通路干預腦缺血再灌注后氧化應激、細胞凋亡、血管生成等生理病理過程[13-14]，但是UDCA 能否通過激活PI3K/AKT 信號通路對腦缺血大鼠發揮神經保護作用，目前尚不清楚。因此，本研究采用線栓法建立大鼠CIRI 模型，通過行為學評價，氧化應激指標檢測，PI3K/AKT 信號通路蛋白測定，闡明其神經保護作用及其機制，為CIRI 尋找新的治療藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD 雄性大鼠40 只，SPF 級，250～280 g，上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部提供，許可證號：SCXK（滬）2018-0006，合格證號：2018000602 1904，SPF 級室溫環境下分籠飼養3 d。本研究經廈門醫學院倫理委員會審批。

1.1.2 藥品與試劑 熊去氧膽酸片（購自上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：41200801）；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride，TTC）（購自大連美侖生物技術有限公司，貨號：J1016A）；BCA 試劑盒（批號：20210105）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號：20210105）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號：20210104）均購自南京建成生物工程研究所；兔單抗PI3K、兔單抗AKT、兔單抗p-AKT 購自Cell Singling 公司。

1.1.3 儀器 Multiskan 全波長酶聯免疫檢測儀（美國熱電公司）；5804R 臺式高速常壓離心機（德國Eppendoff公司）；凝膠成像系統（ChenmidocMP：Bio RAD）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 40 只雄性SD 大鼠按隨機數字表法分為假手術組、大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）組、UDCA 60 mg/kg 組、UDCA 120 mg/kg 組，每組10 只。UDCA 各劑量組預防性灌胃給藥3 d，第4 天通過線栓法構建大鼠MCAO 模型，阻塞1.5 h 后實現再灌注。評分在1～3 分的大鼠判定造模成功，行下一步實驗，UDCA 各劑量組繼續給藥5 d。假手術組與MCAO 組灌胃等量溶劑。

1.2.2 MCAO 模型制備 參照Longa 等[15]方法，于末次給藥1.5 h 后，皮下10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉，大鼠仰臥固定于手術板上。碘伏消毒，沿頸部正中線偏左切一個小口，鈍性分離頸前肌群，再分離出右側頸總、頸內和頸外動脈。動脈夾夾住頸總動脈近心端，再結扎頸外動脈。在距頸總和頸內、外動脈分叉處5 mm處用眼科剪剪一個“V”型小口，將一根魚線圓頭一端從開口處緩慢插入頸內動脈，插入深度18～20 mm，直到前端有阻力無法進入，結扎固定魚線，當動脈阻塞1.5 h 后緩慢拔出魚線實現再灌注，縫合頸部皮膚。假手術組只分離血管，不插魚線，其他操作步驟相同。

1.2.3 神經功能評分 待大鼠蘇醒后，參照Longa 等[15]的評分標準，對大鼠神經功能缺損情況進行評分。無神經功能活動障礙記0 分；提尾時手術對側前爪未完全伸展、內收、屈曲記1 分；大鼠行走時向手術對側不停旋轉記2 分；大鼠行走困難，向手術對側傾倒記3 分；無法自主行走、嚴重意識障礙或陷入昏迷記4 分。評分在1～3 分的判定造模成功，行下一步實驗。

1.2.4 腦梗死范圍的測定 末次給藥后，每組隨機選3 只，斷頭取腦，置于-20℃冰箱，快速冷凍20 min 后，冰塊上去掉小腦、繡球和腦干殘余部分，其余部分用手術刀沿冠狀面將大腦切成5～6 片，迅速將腦片置于2%TTC 染液中，37℃避光染色30 min，15 min 后翻面。取出置于4%多聚甲醛溶液中固定2 h，染色后梗死組織呈蒼白色，正常組織呈玫瑰色，拍照。采用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測量梗死面積。大鼠腦梗死體積=全部腦片梗死面積之和×腦片厚度；大鼠腦梗死組織百分比=大鼠腦梗死體積/全部大腦體積×100%。

1.2.5 SOD、MDA 含量測定 取腦組織0.1 g 置于預冷的生理鹽水冰浴下超聲破碎制備成10%的腦勻漿。4000 r/min 離心10 min，取上清，按試劑盒說明書測定。

1.2.6 PI3K/AKT 相關蛋白測定 取0.25 g 海馬組織加入裂解液充分勻漿，離心后取上清，用BCA 法測定蛋白濃度，取40 μl 樣品，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，轉移到PVDF 膜上，室溫下脫脂奶粉封閉1 h，搖床上洗滌5 min，加入含一抗的孵育盒，4℃孵育過夜，用TBST 在搖床上充分洗滌3 次。將PVDF 膜移入含二抗孵育盒，室溫搖床上孵育2 h，用TBST 充分將膜清洗3 次。按比例配制發光液，將其均勻滴在PVDF 膜上，暗視野下，將PVDF 膜放入凝膠成像儀曝光顯影。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計軟件對數據進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，檢驗方差齊性后，兩組比較采用t 檢驗，多組比較采用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較

MCAO 組大鼠神經功能評分高于假手術組，差異有統計學意義（P ＜0.01）。UDCA 60、120 mg/kg 組大鼠神經功能評分均低于MCAO 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經功能評分比較（分，±s）

注 MCAO：大腦中動脈阻塞；UDCA：熊去氧膽酸。與假手術組比較，aP ＜0.01；與MCAO 組比較，bP ＜0.05

2.2 各組大鼠腦組織TTC 染色結果及腦梗死組織百分比比較

腦組織TTC 染色甲醛固定后，玫瑰紅色部分表示非梗死區，蒼白色部分表示腦梗死區。假手術組腦組織全部為玫瑰紅色，未見梗死病灶；MCAO 組大鼠腦梗死區顯示明顯的蒼白色梗死區。見圖1。MCAO 組大鼠腦梗死組織百分比高于假手術組，差異有統計學意義（P ＜0.01）；UDCA 60、120 mg/kg 組大鼠腦梗死組織百分比均低于MCAO 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腦梗死組織百分比比較（%，±s）

表2 各組大鼠腦梗死組織百分比比較（%，±s）

注 與假手術組比較，aP ＜0.01；與MCAO 組比較，bP ＜0.05。MCAO：大腦中動脈阻塞；UDCA：熊去氧膽酸

2.3 各組大鼠SOD 及MDA 含量比較

MCAO 組SOD 含量低于假手術組，MDA 含量高于假手術組，差異有統計學意義（P ＜0.01）；UDCA 60、120mg/kg 組SOD 含量均高于MCAO 組，UDCA120mg/kg組MDA 含量均低于MCAO 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠SOD 及MDA 含量比較（±s）

表3 各組大鼠SOD 及MDA 含量比較（±s）

注 MCAO：大腦中動脈阻塞；UDCA：熊去氧膽酸；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。與假手術組比較，aP ＜0.01；與MCAO 組比較，bP ＜0.05

2.4 各組大鼠PI3K 及p-AKT 蛋白表達比較

MCAO 組大鼠腦組織缺血側海馬中PI3K、p-AKT蛋白表達低于假手術組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；UDCA 60、120 mg/kg 組大鼠腦組織缺血側海馬中PI3K、p-AKT 蛋白表達高于MCAO 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠PI3K 及p-AKT 蛋白表達情況（n=3）

表4 各組大鼠PI3K 及p-AKT 蛋白表達比較（±s）

表4 各組大鼠PI3K 及p-AKT 蛋白表達比較（±s）

注 與假手術組比較，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；與MCAO 組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。MCAO：大腦中動脈阻塞；UDCA：熊去氧膽酸

3 討論

腦缺血再灌注時產生大量活性氧消耗機體大量抗氧化物質SOD，線粒體能量供應障礙、鈣超載、凋亡因子激活等，進而產生大量MDA，引起氧化應激損傷、神經細胞凋亡及死亡[16-20]。本實驗檢測大鼠腦組織中SOD 及MDA 含量，結果顯示UDCA 可以增強CIRI 大鼠SOD，降低MDA 含量，減輕氧自由基的破壞作用，保護腦神經細胞。

PI3K/AKT 信號通路是經典的抗凋亡和促存活的信號通路，在維持細胞活性、抑制細胞凋亡中發揮重要作用。大量實驗研究表明PI3K/AKT 信號通路在CIRI 中可通過清除活性氧、調控能量產生、抑制凋亡、保護神經元細胞發揮重要作用[21-23]。CIRI 時p-PI3K和p-AKT/AKT 顯著下降，PI3K/AKT 信號通路處于關閉狀態，而藥物干預后p-PI3K 和p-AKT/AKT 顯著升高，通過發揮抗凋亡作用使CIRI 明顯減輕[24-28]，因此PI3K/AKT 通路對于CIRI 治療是一個很有希望的靶點。本研究中MCAO 組p-AKT 蛋白表達顯著下降，腦梗死體積增加，神經功能損傷嚴重，而UDCA 60 mg/kg組、UDCA 120 mg/kg 組p-PI3K 蛋白表達較MCAO組顯著升高，因此推測UDCA 可能激活PI3K/AKT 信號通路，緩解腦缺血再灌注對腦細胞造成的損傷。

綜上，本研究結果提示UDCA 對CIRI 具有很好的保護作用，改善大鼠一般狀況，降低腦梗死體積，減少神經功能損傷，促進抗氧化酶活性，抑制過氧化產物生成。其作用機制可能通過抗氧化應激損傷及磷酸化激活PI3K/AKT 信號通路，發揮對CIRI 的保護作用。