LAMβ1 聯合ARPC4 檢測在結直腸癌診斷中的應用

徐 浩 楊 杰 袁 園

1.南通大學附屬如皋醫院 江蘇省如皋市人民醫院腫瘤化療科，江蘇如皋 226500；2.南通大學附屬如皋醫院 江蘇省如皋市人民醫院腫瘤放療科，江蘇如皋 226500

結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，惡性細胞能夠從原發腫瘤散播并轉移到遠處器官，具有發病隱匿、術后易復發及死亡率高的特點[1]。數據調查顯示，我國結直腸癌患者每年以4.2%的速度遞增，且5 年生存率低于20%[2-3]。臨床研究發現，早期診斷有助于及時采取有效治療方案，降低死亡率。層粘連蛋白β1（lamininβ1，LAMβ1）是細胞外基質蛋白家族中的成員之一，參與基底膜組成及細胞黏附、增殖、分化等過程，能夠促進腫瘤惡性表型的發生[4]。有研究報道，結直腸癌的發生是一個多基因、多步驟、多階段性的演變過程，癌變過程涉及基因的異常表達[5]。肌動蛋白相關蛋白2/3 復合體4（actin-related protein 2/3 complex 4，ARPC4）是由7 個亞單位組成的復合體，能夠促進肌動蛋白單體核化裝配形成微絲，參與磷脂酰肌醇3-激酶信號通路調節，促進與多種腫瘤細胞的增殖、侵襲[6]。然而，LAMβ1 和ARPC4 在結直腸癌患者中的變化及診斷價值尚不清楚。鑒于此，本研究探討結直腸癌患者癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達水平及其臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020 年3 月至2021 年3 月江蘇省如皋市人民醫院收治的74 例結直腸癌患者的癌組織標本和癌旁組織標本。其中，結直腸癌患者男42 例，女32 例；年齡20～76 歲，平均（51.85±8.37）歲；分化程度：高分化14 例，中分化39 例，低分化21 例；臨床TNM 分期：Ⅰ期32 例，Ⅱ期22 例，Ⅲ期14 例，Ⅳ期6 例。本研究經江蘇省如皋市人民醫院醫學倫理委員會批準。

納入標準：結直腸癌患者符合《結直腸癌規范化診療》[7]中結直腸癌診斷標準；經組織病理學確診，且入組前接受任何治療；年齡20～78 歲；知情同意。排除標準：合并其他惡性腫瘤；合并心肝腎等重要臟器嚴重功能障礙；合并血液系統疾病；合并精神疾病；合并急慢性腸炎、炎癥性腸病等消化系統疾病；合并急性泌尿感染、結核菌感染等感染性疾病。

1.2 檢測方法

實時熒光定量PCR 檢測：按照試劑盒說明書提取癌組織和癌旁組織總RNA，使用逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen 公司）進行逆轉錄，產生cDNA，在聚合酶作用下擴增，擴增條件：95℃預變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，進行40 個循環。采用Mygo 熒光定量PCR 儀（北京群曉科苑生物技術有限公司）進行檢測，設置U6 為內參對照，每個反應3 個復孔，計算平均值，采用2-ΔΔCt法獲得的LAMβ1、ARPC4 mRNA 相對表達量。相關引物序列見表1。

表1 引物序列

免疫印跡法測定：取患者組織樣本置于離心管中，加入組織裂解液勻漿，12 000 r/min 離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清，采用試劑盒測定蛋白水平，并定量，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，然后將蛋白轉移到PVDF 膜上，室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜，隔天加入二抗，37℃下孵育2 h，最后加發光底物曝光顯示目的條帶，掃描膠片，采用凝膠成像儀分析軟件測定蛋白條帶密度值，目的蛋白與內參的比值為蛋白表達相對定量。

所有患者均以病理學檢查結果為“金標準”，均進行內鏡活組織檢查，手術切除活檢標本，制作石蠟切片，并進行HE 染色，采用光學顯微鏡觀察，腫瘤穿透黏膜肌層并到達黏膜下層即可診斷為結直腸癌[8]。

1.3 觀察指標

①比較癌組織和癌旁組織LAMβ1、ARPC4 mRNA表達。②比較癌組織和癌旁組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達。③分析LAMβ1 聯合ARPC4 診斷結直腸癌的價值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，采用配對t 檢驗；計數資料以例數或百分率表示，采用χ2檢驗；采用受試者操作曲線（receiver operating curve，ROC）分析LAMβ1聯合ARPC4 蛋白表達水平診斷結直腸癌的價值。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌組織和癌旁組織LAMβ1 及ARPC4 mRNA 表達比較

結直腸癌組織LAMβ1、ARPC4 mRNA 表達水平高于癌旁組織（P ＜0.05）。見表2。

表2 癌組織和癌旁組織LAMβ1 及ARPC4 mRNA 表達比較（）

表2 癌組織和癌旁組織LAMβ1 及ARPC4 mRNA 表達比較（）

注 LAMβ1：層粘連蛋白β1；ARPC4：肌動蛋白相關蛋白2/3 復合體4

2.2 癌組織和癌旁組織LAMβ1 及ARPC4 蛋白表達比較

結直腸癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達水平高于癌旁組織（P ＜0.05）。見表3。

表3 癌組織和癌旁組織LAMβ1 及ARPC4 蛋白表達比較（）

表3 癌組織和癌旁組織LAMβ1 及ARPC4 蛋白表達比較（）

注 LAMβ1：層粘連蛋白β1；ARPC4：肌動蛋白相關蛋白2/3 復合體4

2.3 癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達水平診斷結直腸癌的價值

ROC 分析顯示，癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達水平診斷結直腸癌的最佳截斷點分別為1.02 和0.94，靈敏度分別為78.38%和81.08%，特異度分別為82.43%和78.37%，曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.815、0.804，約登指數分別為0.608、0.595，兩者聯合的特異度、AUC 和約登指數分別為98.65%，0.873 和0.757。見表4、圖1。

表4 癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達水平診斷結直腸癌的價值

圖1 LAMβ1、ARPC4 蛋白表達水平診斷結直腸癌的ROC

3 討論

結直腸癌是一種發病率高、死亡率高的惡性腫瘤，然而，患者早期癥狀不明顯，臨床確診時已進入晚期，錯過最佳治療時機[9-12]。臨床早期診斷有助于提高救治率，近年來，關于結直腸癌的早期診斷逐漸引起醫學研究者的廣泛關注[13]。腫瘤標志物是惡性腫瘤的診斷參考指標，已被廣泛應用于惡性腫瘤的臨床診斷，癌胚抗原是臨床常用的惡性腫瘤標志物，在監測結直腸癌診斷以及預后預測中具有重要價值，然而，癌胚抗原診斷結直腸癌的特異度較低，影響臨床診斷結果[14-16]。因此，臨床亟須尋找有效診斷結直腸癌的方法。

本研究中結直腸癌組織LAMβ1、ARPC4 mRNA表達水平高于癌旁組織，且結直腸癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達水平高于癌旁組織，提示LAMβ1、ARPC4 蛋白表達在結直腸癌的發生、發展中具有重要影響。LAMβ1 是細胞外基質中的一種非膠原糖蛋白，是細胞間質中基底膜的主要成分，在腫瘤浸潤和轉移及基底膜相互作用中發揮重要作用，其主要通過腫瘤細胞表面的LAMβ1 受體與基底膜中層LAMβ1相互識別與結合完成[17]。此外，腫瘤細胞對于基底膜的降解、黏附和破壞是腫瘤浸潤、轉移的重要標志，LAMβ1 通過整合素的信號介導可以參加細胞的增殖、黏附、侵襲、遷移和血管生成等活動[18]。結直腸癌患者LAMβ1 蛋白表達水平升高可能與腫瘤細胞降解以及破壞基底膜和腫瘤組織中的大量新生毛細血管細胞膜有關[19]。研究發現，ARPC4 是肌動蛋白組裝成核劑，肌動蛋白組成微絲構成細胞骨架，是細胞運動偽足的主要成分，能夠促進微絲合成作用，參與細胞運動[20]。細胞骨架主要由微絲、微管和中間纖維組成，參與細胞增殖、分化、運動等重要生命活動，ARPC4對于腫瘤細胞骨架功能及結構改變影響腫瘤的發生及發展[21]。ARPC4 通過促進惡性腫瘤在基質中運動，為腫瘤細胞的浸潤提供有利條件[22]。臨床研究證實，ARPC4 下調后腫瘤細胞系遷移能力出現明顯降低，降低ARPC4表達可抑制癌細胞的侵襲能力[23]。李合等[24]研究報道，結直腸癌患者血清LAMβ1 水平異常升高。王亞儒等[25]研究報道，結直腸癌患者癌組織中ARPC4 表達水平升高，與本研究結果相符。ROC分析顯示，癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達水平分別以1.02 和0.94 為最佳截斷點時，均可作為診斷結直腸癌的敏感指標，且兩者聯合時診斷價值更高。任海亮等[26]研究報道，ARPC4與結直腸癌的轉移有關，臨床檢測ARPC4 可作為預測結直腸癌預后的敏感指標。因此，臨床檢測結直腸癌患者癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達水平變化，可作為監測結直腸癌發生的敏感指標，兩者聯合診斷能夠提高準確率。

綜上，結直腸癌患者癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達水平異常升高，兩者均可作為診斷結直腸癌的敏感指標，兩者聯合診斷價值更高。然而，本研究病例選取有限，研究結果可能存在一定偏倚，仍需擴大樣本量，進行多中心研究，進一步證實癌組織LAMβ1、ARPC4蛋白表達水平在結直腸癌中的診斷價值，并深入探究LAMβ1、ARPC4 蛋白表達在結直腸癌發生、發展中作用機制。