桂枝茯苓丸調控多囊卵巢綜合征大鼠MMP-9/TIMP-1平衡的研究*

河北中醫學院

李顥玥 王 茜 韓 雪 石 鋮 郝 蕾(石家莊 050091)

提要 目的：研究桂枝茯苓丸對多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠血清及卵巢組織中基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)及其抑制物基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)水平的影響。方法：60只SD雌性大鼠隨機分為正常組、模型組、克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組；采用股骨內側皮下注射胰島素注射液和人絨毛膜促性腺激素(HCG)復制大鼠PCOS模型。連續治療35 d后，測量體質量，收集血清、卵巢組織標本，采用酶聯免疫法(ELISA)測定血清睪酮(T)、黃體生成素(LH)、卵泡成熟素(FSH)、MMP-9、TIMP-1的含量；光鏡下觀察卵巢組織的病理形態學變化；免疫組化法觀察大鼠卵巢組織MMP-9、TIMP-1的表達情況。結果：與正常組相比，模型組體質量增加，血清T、LH、FSH、MMP-9水平升高，TIMP-1水平降低，卵巢可見竇腔明顯擴大的囊性竇卵泡。與模型組相比，克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組體質量改善，血清T、LH、FSH、MMP-9水平均明顯降低，TIMP-1水平升高，卵巢囊性竇卵泡減少，竇腔變小，各時期卵泡增多，黃體數目增多。結論：桂枝茯苓丸高、低劑量組均可明顯改善PCOS大鼠癥狀，調控大鼠血清及卵巢組織中MMP-9、TIMP-1水平，且桂枝茯苓丸高劑量組療效優于低劑量組。

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內分泌紊亂綜合征，以持續無排卵、雄激素過多和胰島素抵抗(IR)為主要特征[1]，是育齡期婦女最常見的婦科內分泌疾病。研究發現PCOS在育齡期婦女中的發病率高達18%，且呈逐年升高的趨勢[2]，嚴重影響女性的生殖健康。

PCOS在中醫中屬于“月經不調”“癥瘕”“不孕”等范疇[3]，病因錯綜復雜，中醫認為本病與脾腎功能失調及痰濕、血瘀阻滯等密切相關[4]，其病機本質可能為腎虛引起的脾虛、肝郁及氣血失調等[5]。桂枝茯苓丸首見于《金匱要略》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、芍藥組成，主婦人宿有瘕病，經斷未及三月，而得漏下不止，胎動在臍上者，為瘕痼害[6]。方中桃仁、牡丹皮、白芍活血化瘀、養血和血，使瘀血去，新血生；桂枝溫通血脈，助桃仁、牡丹皮活血之力；茯苓利水滲濕，寓有濕祛血止之用，五藥合用共奏化瘀生新、調和氣血之功[7-9]，與PCOS主要病機相符。

現代研究顯示，基質金屬蛋白酶(MMPs)以及特異性組織抑制物(TIMPs)對排卵有重要的生理作用，可以通過調節卵巢內細胞外基質(ECM)成分的降解和重建，參與PCOS排卵障礙的病理過程[10-12]。為了進一步闡明桂枝茯苓丸的作用機制，本實驗通過測定PCOS模型大鼠體質量、血清及卵巢組織中血清睪酮(T)、黃體生成素(LH)、卵泡成熟素(FSH)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)在治療前后的變化，探索其對PCOS的影響，為繼承發展桂枝茯苓丸的臨床應用提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只成年SD大鼠，清潔級，雌性，體質量180～200 g，由河北醫科大學動物實驗中心提供。許可證號：SCXK(冀)2018-004。實驗室內通風良好，溫度保持在20 ℃～25 ℃。本研究獲得河北中醫學院動物倫理委員會的批準。

1.2 實驗藥物 胰島素注射液(購于江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，國藥準字H10890001)、0.9%氯化鈉注射液(購于石家莊四藥有限公司，國藥準字H13023200)、人絨毛膜促性腺激素(HCG，購于麗珠集團麗珠制藥廠，2 000 U/瓶，國藥準字H44020674)、葡萄糖(Vetec reagent grade，規格：500 g/瓶， Lot：WXBC2393V)、桂枝茯苓丸(購于江蘇康緣藥業股份有限公司，規格：0.31 g/粒，國藥準字Z10950005)、克羅米芬片(購于高特制藥有限公司P.O. Box51785Limassol，塞浦路斯，規格：50 mg/片，《進口藥品注冊證》證號：H20140688)。

1.3 實驗試劑與儀器 大鼠T、LH、FSH的ELISA試劑盒均購于德國IBL公司(批號20161130)；MMP-9、TIMP-1兔單克隆抗體均購于英國Abcam公司(批號分別為GR426511-4和GR238752-1)；MMP-9、TIMP-1單克隆抗體，SP-KITT9000試劑盒均購于美國ZYMED公司；防脫片劑APES、顯色劑DAB均購于北京中山生物技術有限公司。BX43F型顯微鏡[奧林巴斯(中國)有限公司]，H17502型冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)，Versa MaxTM多功能酶標儀(美國Molecular Devices)。

1.4 造模、分組及給藥

1.4.1 模型制備：采用股骨內側皮下注射胰島素注射液(初始濃度為0.5 U/d，后每天遞增0.5 U，直至6.0 U/d不變)和HCG(1.5 U/d)復制PCOS模型，共注射21 d。造模期間，為防止低血糖發生，以5%葡萄糖溶液代替日常飲水。

1.4.2 分組給藥：將60只大鼠隨機分為正常組、模型組、克羅米芬組、桂枝茯苓丸高劑量組、桂枝茯苓丸低劑量組，每組12只。除正常組外，其他大鼠造模成功后，克羅米芬組給予相當于生藥0.21 g/kg·d-1灌胃，桂枝茯苓丸高劑量組給予相當于生藥2.33 g/kg·d-1灌胃，桂枝茯苓丸低劑量組給予相當于生藥1.16 g/kg·d-1灌胃，各組連續用藥35 d。正常組與模型組給予同體積生理鹽水灌胃。所有大鼠每周稱量體質量1次。

1.5 標本采集 末次給藥后，對所有大鼠禁食禁水24 h，腹腔注射10 %水合氯醛麻醉，自腹主動脈取血，將血樣在4 ℃下以3 000 r/min離心5 min，分離血清；取血后，將大鼠以頸椎脫臼處死，剖腹取出并迅速分離大鼠兩側卵巢，取相同側卵巢對切，置于濃度為4 %的福爾馬林液中固定、石蠟包埋，切片。

1.6 指標檢測 將卵巢組織的石蠟切片進行HE染色，在光鏡下觀察卵巢的病理變化情況。采用酶聯免疫法(ELISA)檢測大鼠血清T、LH、FSH、MMP-9、TIMP-1含量，并計算MMP-9/TIMP-1比值。用免疫組化法檢測大鼠卵巢組織中MMP-9、TIMP-1的表達，用顯微鏡的Optimas數字彩色圖像顯微系統(optimas 6.51,美國)進行病理圖像分析，計算各區域平均灰度值。平均灰度值越高，表明陽性表達越弱，平均灰度值越低，表明陽性表達越強[13]。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量變化情況 與正常組相比，模型組大鼠體質量增長值升高(P<0.01)，說明PCOS大鼠模型復制成功。與模型組相比，克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組大鼠體質量增長值均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。說明用藥后PCOS大鼠肥胖癥狀有了改善。詳見表1。

表1 各組大鼠體質量變化情況

2.2 各組大鼠卵巢組織形態學情況變化 正常組大鼠卵巢在光鏡下可見黃體和發育于各時期的卵泡，卵泡的組織結構清晰，卵泡壁由8～9層形狀完整、排列整齊的顆粒細胞組成，卵泡膜細胞呈現梭狀排列，可見卵細胞、透明帶以及放射冠結構，膜-間質細胞無增生現象，無囊性竇卵泡的出現。與正常組相比，模型組大鼠卵巢可見竇腔明顯擴大的囊性竇卵泡，顆粒細胞層數明顯減少，卵母細胞及放射冠消失，黃體組織數目明顯減少甚至消失，并有不完全的黃素化，膜細胞明顯增生。與模型組相比，克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組大鼠卵巢囊性竇卵泡數量減少，竇腔變小，顆粒細胞層數增加，黃體數目增加。其中，桂枝茯苓丸高劑量組大鼠顆粒細胞及黃體數目的改善情況明顯好于低劑量組。各組大鼠卵巢組織形態學變化見圖1。

注：1.正常組；2.模型組；3.克羅米芬組；4.桂枝茯苓丸低劑量組；5.桂枝茯苓丸高劑量組。(圖2、圖3同)圖1 各組大鼠卵巢組織形態學變化(HE，×100)

2.3 各組大鼠血清中T、LH、FSH水平情況比較 與正常組相比，模型組大鼠血清T值和LH值均明顯升高(P<0.01)，說明PCOS大鼠模型復制成功。與模型組相比，克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組大鼠血清T值、LH值及FSH值均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。說明用藥后PCOS大鼠血清T值、LH值及FSH值升高的癥狀有了改善。詳見表2。

表2 各組大鼠血清中T、LH及FSH水平的變化情況

2.4 桂枝茯苓丸對PCOS大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清MMP-9水平升高，TIMP-1水平降低，MMP-9/TIMP-1比值升高(P<0.01)；與模型組比較，克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組大鼠血清MMP-9水平降低，TIMP-1水平升高，MMP-9/TIMP-1比值降低。詳見表3。

表3 各組大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1比值變化

2.5 桂枝茯苓丸對PCOS大鼠卵巢組織MMP-9、TIMP-1表達的影響 各組卵巢中卵泡的顆粒細胞和發育良好的卵泡膜間質細胞中均可檢測到MMP-9和TIMP-1的雜交信號。與正常組相比，模型組卵泡顆粒細胞和卵泡膜細胞中MMP-9的灰度值均下降，TIMP-1的灰度值均升高，差異具有顯著性(P<0.01或P<0.05)；與模型組相比，克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組卵泡顆粒細胞及卵泡膜細胞中MMP-9的灰度值均升高，TIMP-1的灰度值均降低，差異具有顯著性(P<0.01或P<0.05)。詳見表4、圖2、圖3。

表4 各組大鼠卵巢局部MMP-9、TIMP-1陽性細胞平均灰度的比較

圖2 免疫組化法觀察各組大鼠卵巢組織中MMP-9的表達(免疫組化，×100)

圖3 免疫組化法觀察各組大鼠卵巢組織中TIMP-1的表達(免疫組化，×100)

3 討論

PCOS臨床表現為持續性的無排卵、胰島素抵抗和高雄激素，是現代常見的婦科生殖障礙性疾病之一，也是導致女性不孕的主要因素之一，嚴重影響了女性的身心健康[14-15]。研究發現，PCOS的發病機制可能與腎上腺功能紊亂、下丘腦-垂體-卵巢軸功能失常和反饋異常等有關[16]，垂體分泌和釋放FSH、LH的功能紊亂，會進一步導致FSH的促卵泡成熟和排出的功能障礙以及LH誘導的排卵障礙[17-18]。而FSH介導的芳香化酶受到抑制，則使T水平持續升高，性激素水平紊亂加劇。因此，T、LH、FSH可能為影響PCOS大鼠發情周期的重要指標[19]，其主要變化趨勢為PCOS的發病會導致性激素T、LH、FSH水平的升高[20]。PCOS在中醫學屬“月經不調”“不孕”等范疇，臨床研究表明，桂枝茯苓丸在治療PCOS方面有明顯優勢[21]。

本實驗采用給大鼠股骨內側皮下注射胰島素和HCG的方法進行PCOS造模，主要依據是胰島素能刺激卵巢卵細胞膜和間質細胞合成雄激素，降低血中性激素結合蛋白，使卵巢雄激素濃度增加，導致卵泡閉鎖，形成多囊[22]?？肆_米芬為人工合成的非甾體制劑，具有較強的抗雌激素效應和較弱的雌激素作用，臨床常用于治療PCOS等無排卵的女性不孕癥，因此本實驗選取其為陽性對照藥物。結果顯示，造模后大鼠體質量明顯增加，血清中T、LH水平均明顯升高，卵巢可見竇腔明顯擴大的囊性竇卵泡，表明造模成功。與模型組比較，桂枝茯苓丸高、低劑量組大鼠血清T、LH、FSH水平均明顯降低，卵巢囊性竇卵泡數量減少，竇腔變小，顆粒細胞層數增加，黃體數目增多；其中桂枝茯苓丸高劑量組較低劑量組血清水平變化更為明顯，卵巢中也可見4～6層形狀完整、排列較緊湊的顆粒細胞，黃體數目多于低劑量組。

MMPs是LH依賴的調節卵泡破裂和早期黃體形成的重要因子之一[23]，而TIMPs的表達也有助于調節卵泡破裂和向黃體轉化，且二者均定位于卵泡的顆粒細胞、膜細胞及基質細胞上[24]，受激素、生長因子和細胞因子的調控[25-26]，通過調節卵巢動態結構成分的周期性變化，對卵泡和黃體功能發揮著極為重要的作用，在排卵和黃體形成過程中相互作用共同協調。在正常的排卵過程中，卵泡的發育成熟、排卵以及黃體的形成和退化都依賴于細胞外基質(ECM)周期性的有序降解和組織重建，MMPs/TIMPs蛋白水解酶家族的精確調控在ECM重塑過程中起著非常重要的作用[27]。MMP-9通過降解基質膜的主要成分參與排卵和卵泡的生長，是分解ECM的關鍵因子[28]，而TIMP-1則對MMP-9有抑制作用，因此MMP-9/TIMP-1比例正常對于維持黃體細胞所依賴的ECM微環境極為重要。

實驗結果顯示，PCOS模型大鼠卵巢組織顆粒細胞和卵泡膜細胞中存在MMP-9的異常高表達，TIMP-1異常低表達，提示PCOS有明顯增高的溶解明膠的活性，這可能與多個卵泡發育和囊腫形成時卵巢ECM重塑的增加有關，增高的MMP-9使卵巢ECM降解異常，從而使多囊卵泡形成，逐漸發展為慢性無排卵。模型組大鼠血清中MMP-9/TIMP-1比值高于正常組，說明MMP-9/TIMP-1的平衡向蛋白酶活性增強方向移動，可能因為PCOS較厚的卵巢皮質需要更多的蛋白酶進行水解，TIMP-1的降低是對卵巢被膜增厚的一種代償機制。MMP-9/TIMP-1比值升高可能與PCOS的排卵障礙有關。桂枝茯苓丸能降低MMP-9的異常高表達，升高TIMP-1的異常低表達，降低MMP-9/TIMP-1比值，推測其可能通過抑制LH的分泌，阻斷外周靶器官雄激素的作用，使卵巢ECM降解恢復正常，通過正反饋激發排卵。

綜上所述，桂枝茯苓丸能調節PCOS大鼠血清激素水平，改善組織結構，達到治療效果，且高劑量組療效優于低劑量組。桂枝茯苓丸治療PCOS的機制，可能與抑制膠原增生、減少膠原沉積、增加膠原降解、促進正常組織細胞增殖有關。