miR-429在低氧環境中對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響

黃江，焦旭峰，安帥，王居勇，曹光磊，沈惠良

(首都醫科大學宣武醫院骨科，北京 100053)

隨著老齡化社會的發展，骨質疏松性骨折成為老年人群常見且嚴重的疾患。骨折發生后由于疼痛及臥床，患者活動減少，骨量進一步丟失[1]。骨質疏松性骨折具有骨量差、修復慢、內固定穩定性弱且失敗率高等特點，因此術后骨折不愈合和延遲愈合成為常見的并發癥[2]。作者前期的研究發現在體內用氯化鈷(CoCl2)模擬低氧環境可以改善成骨和骨折愈合[3-4]，然而低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α調控骨折愈合及其如何參與成骨細胞分化的機制尚不明確。

近年來，微小RNA(microRNA，miRNA)成為研究熱點，它是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在細胞內具有多種重要的調節作用[5]。本研究中將重點關注在低氧環境中會顯著上調的miR-429[6]，通過觀察miR-429在低氧環境中對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響，明確miR-429對成骨分化的作用，從而揭示低氧調控骨愈合新的機制。

1 資料與方法

1.1 細胞培養及低氧誘導 前成骨細胞系MC3T3-E1購買于美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)(Manassas，VA，USA)，HEK293T細胞購買于上海細胞生化所。細胞在Dulbecco氏培養基(Dulbecoo's modified eagle medium，DMEM)(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)中培養，并加入10%牛胎兒血清(Life Technologies)，100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素，37℃，5% CO2培養環境中生長。

氯化鈷組在培養基中加入200 μmol/L的CoCl2，對照組使用常規培養基。在特定的時間點提取RNA和蛋白質，細胞誘導成骨使用成骨誘導培養基(完全培養基中添加10 mmol的β-磷酸甘油和50 μg/mL的抗壞血酸)，誘導前成骨細胞MC3T3-E1分化，每2天更換1次。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR) 根據試劑盒說明書使用Trizol從組織和細胞中提取總RNA。miR-429的表達則根據說明書使用TaqMan探針檢測miR-429表達，U6作為內參。所有反應分3個重復進行，并進行3次獨立測定。

1.3 質粒構建 使用聚合酶鏈式反應擴增從小鼠基因組DNA編碼pre-miR-429序列加上兩側側翼150 bp的片段，用于擴增的引物如下：(正向)5'-AAA GAA TTC AGT CTG C TG TGG CTG TAA CCG-3'，(反向)5'-AAA GGA TCC CCA AAG AGG TGC TAT GAC GAGC-3'。然后將PCR產物克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-puro載體(System Biosciences，Mountain View，CA，USA)的EcoRI/BamHI位點。通過限制酶消化和測序確認所有質粒。將轉染過表達miR-429質粒的細胞作為實驗組，對照組為轉染空載質粒的細胞。

1.4 細胞增殖和凋亡測定 根據試劑盒說明書通過細胞計數試劑-8(cell counting kit-8，CCK-8)(Dojindo，Japan)測定細胞活力。將100 μL細胞懸浮液中的3×103個細胞接種到96孔板的每個孔中培養過夜，分別在0 h、24 h、48 h和72 h向每個孔中加入10 μL CCK-8溶液。通過酶標儀(Bio-Rad Laboratories)在450 nm下測量光密度(optical density，OD)。細胞凋亡水平按照Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒I(BD Biosciences)說明書評估細胞凋亡。

1.5 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性測定 根據說明書，使用WAKO LabAssay TM ALP凋亡檢測試劑盒(LabAssay TM ALP，Wako，Japan)測定不同條件處理細胞的ALP活性。總蛋白質濃度作為ALP活性測定內參。

1.6 茜素紅S染色 不同條件下處理的細胞首先固定，然后使用1%茜素紅S溶液(Sigma-Aldrich)染色。使用光學顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)拍攝5個200倍隨機非重疊區域的照片。通過Image J軟件(NIH，Bethesda，MD，USA)提取來評估茜素紅S染色的定量。

1.7 免疫蛋白印跡(western blot，WB) 用含有完全蛋白酶抑制劑(Roche，Mannheim，Germany)的ripa緩沖液裂解組織和細胞。在10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺梯度凝膠(Bio Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)上分離蛋白質，并轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜(Millipore，Billerica，MA)。封閉后將膜分別與兔多克隆HIF-1α抗體(1∶800，Abcam)、兔多克隆ALP抗體(1∶100，Abcam)、兔多克隆OC抗體( 1∶100，Thermofisher)以及兔多克隆Runt相關轉錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)抗體(1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology)在4℃孵育過夜。使用化學發光試劑(Millipore，Temecula，CA，USA)在LAS4000發光圖像分析儀(GE Healthcare Japan，Japan)中曝光。

1.8 動物實驗 本研究動物實驗均經過首都醫科大學宣武醫院動物倫理委員會批準，許可證號為XW-20210410-1。所有5日齡Swiss小鼠均獲自首都醫科大學宣武醫院實驗動物中心。使用骨折裝置制作小鼠骨折模型(每組8個)[7]。將100 μL過表達miR-429慢病毒(1×109TU/mL)直接注射到實驗組局部骨折的皮下區域。在骨折后第14天及第21天應用首都醫科大學的Inveon Micro-CT (Siemens AG，Munich，Germany)對骨折部位標本進行逐一掃描(層厚15 μm，500 μa，80 kV)，將數據導入Mimics 16.0(Materialise NV，Leuven，Belgium)進行三維重建，在骨折線遠近端1cm通過軟件選取骨痂邊界測得骨痂體積[8]。

2 結 果

2.1 miR-429在低氧環境中表達情況 在MC3T3-E1細胞培養基中加入CoCl2培養可以上調HIF-1α的表達(見圖1a)，實現模擬低氧環境。通過qRT-PCR檢測各個時間點的miR-429的表達。研究發現在實現低氧環境的同時上調了miR-429的表達，并在4 h達到峰值(見圖1b)。為了進一步證明體外培養的結果，作者檢測了小鼠骨折模型中CoCl2治療后骨折部位miR-429的表達，結果和體外實驗一致，miR-429的表達在骨折后第7天顯著上調，并在第14天能觀察到miR-429的上調(見圖1c)。通過CCK-8檢測證實在培養基中加入CoCl2并不影響細胞的增殖與凋亡(見圖1d～e)。體內、外實驗均證明在低氧環境的成骨過程中miR-429顯著上調，其可能參與骨折愈合的分子調節。

a HIF-1α蛋白水平比較 b 細胞中miR-429表達水平比較 c 骨組織中miR-429表達水平比較

2.2 miR-429對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響 通過慢病毒轉染技術過表達miR-429，細胞在轉染miR-429慢病毒72 h后miR-429的表達明顯增加，證明MC3T3-E1細胞成功轉染miR-429慢病毒(見圖2a)。之后為了證明miR-429在MC3T3-E1細胞成骨分化中的作用，采用ALP活性檢測試劑盒比較兩組細胞中ALP的活性，結果顯示miR-429組中ALP的活性明顯高于對照組，在第7天、第14天和對照組相比分別提高了近1.6倍、1.9倍(見圖2b)。同時第21天用茜素紅S染色發現miR-429組中礦物質的含量也明顯增加(見圖2c～d)。另外，在第21天及28天通過WB試驗發現miR-429組中成骨標志物ALP、OC、RUNX2的蛋白水平均明顯高于對照組(見圖2e)。因此，在MC3T3-E1細胞中過表達miR-429可以促進成骨分化。

a 轉染miR-429表達水平比較 b 各時間點ALP活性檢測水平比較 c 細胞礦物化水平比較

2.3 MiR-429可以改善骨折修復過程中骨組織的形成和重建 研究中為了確認miR-429在體內是否可以改善骨折愈合，將過表達miR-429的慢病毒制備成試劑皮下局部注射在骨折部位，然后在骨折后14、21 d行micro-CT檢查并進行骨痂量的測定。14 d時實驗組的CT冠狀位可見骨痂明顯增厚，成骨能力增強；21 d時實驗組骨折線基本消失，骨痂量較14 d時減少，骨痂塑形質量比對照組高(見圖3a)。結果顯示miR-429組的骨痂量高于對照組(見表1)。采用qRT-PCR技術檢測骨折部位骨組織中miR-429的表達情況，發現miR-429組中骨折部位的miR-429表達也高于對照組(見圖3b)。

a micro-CT檢測兩組骨痂情況比較

表1 兩組micro-CT測量骨痂量的比較

3 討 論

近年來，大量研究證實miRNA對許多生命活動起到了非常重要的調控作用，例如細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡和器官發育[9]。在成骨過程中miRNA可以通過調節成骨細胞和軟骨細胞功能、血管生成以及其他對骨形成至關重要的過程來實現骨愈合[10]。在分子生物學方面，最近研究發現多種miRNA可增強骨形態蛋白的表達，在小鼠的股骨骨折模型中miR-186可以通過抑制SMAD6來激活BMP信號通路促進骨折愈合[11]，在大鼠的骨折模型中抑制miR-9的表達可以靶向miR-9/BMP-7的信號通路促進骨折愈合[12]。miRNA同樣可以調節多種骨形成的信號通路，Jia等[13]發現MiR-367在小鼠骨折模型中高表達，但PANX3、β-連環蛋白和Wnt5b在骨折小鼠中低表達。下調miR-367增加了PANX3、β-連環蛋白和Wnt5b的mRNA和蛋白質表達，同時可以增加了成骨細胞的生長、增殖和遷移，減少了細胞凋亡。另外有研究表明，miR-2通過調節同源性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog，PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)/HIF-1α信號途徑促進成骨，并增強骨缺損的再生[14]。

骨折后的組織由于血管損傷以及軟組織腫脹導致低氧狀態的出現，有研究報道骨折部位的組織氧含量僅2%，大大低于正常骨組織的6%～8%[15]。同時也有研究證明低氧環境會抑制成骨細胞的分化和增殖，但HIF-1α的表達在調節低氧環境中成骨細胞分化的過程中發揮重要的作用[16]。本研究發現在大鼠骨折模型中局部注射CoCl2可以通過提高HIF-1α的表達來促進骨折愈合[3]。HIF被認為可以在多種病理條件下強有效地刺激血管生成和細胞代謝，同時一系列的低氧調控的microRNAs在低氧狀態下被發現[17]，從而給我們提供了一種新方式去了解低HIF和骨組織愈合之間的調控關系。miR-429是miR-200家族成員之一，在低氧條件下人羊膜間充質干細胞(humanamnioticmes-enchymalstromalcells，hAMSC)中會顯著上調，miR-429通過促進HIF-1α的合成，增加血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和Bcl-2蛋白水平。miR-429通過介導HIF-1α的表達，負性調節HAMSC的存活和抗凋亡能力，并提高hAMSC的耐缺氧能力[6]。

因此，本研究關注于低氧調節因子miR-429，它可能參與了CoCl2模擬低氧促進MC3T3-E1成骨細胞的分化。本研究通過RNA和蛋白水平的檢測證實了在體內、外的成骨過程中低氧環境可以增加miR-429的表達；同時過表達miR-429能增加MC3T3-E1細胞的ALP活性、骨組織礦化以及成骨標志物的蛋白表達，這表明miR-429對成骨分化有促進作用，體內實驗也同樣證明過表達miR-429的病毒試劑可以增加骨痂體積促進骨折愈合。

綜上所述，miR-429在低氧環境中可以促進MC3T3-E1細胞的成骨分化，能夠增加成骨標志物的表達及組織礦化，是一種新型的可以促進成骨分化的調節因子，為低氧調控骨折愈合提供一種新的機制。