FGF-18治療骨關(guān)節(jié)炎的研究進展

楊振興，劉大鵬

(新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院骨二科，新疆 烏魯木齊 830011)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見的累及關(guān)節(jié)的疾病，并且呈逐年上升趨勢[1-2]。骨關(guān)節(jié)炎的患者以關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、壓痛、僵硬等癥狀最為常見，嚴重時會導(dǎo)致殘疾，極大地降低了患者的生活質(zhì)量[3]。由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏自我愈合能力，目前尚未出現(xiàn)可以治愈的方法，因此治療OA的重點在于減輕患者疼痛和改善關(guān)節(jié)功能狀態(tài)[4]。藥物治療對緩解疼痛有比較優(yōu)秀的療效，成為目前比較主流的治療方法，但另一方面應(yīng)用藥物治療經(jīng)常伴隨著各種不良事件[5]。而新興的再生療法能夠有效地促進組織的修復(fù)和再生，有效地促進了關(guān)節(jié)的修復(fù)。

成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)-18是一種含有207個氨基酸，相對分子量為23731Da的蛋白。其在45-164氨基酸位點存在氨基酸保守核心，在FGF家族中第18個被發(fā)現(xiàn)，并于1998年首次報道[6]。FGF-18是與FGF-8和FGF-17具有高同源性的FGF，起源于神經(jīng)外胚層細胞和各種間葉細胞[7]。FGF-18在骨骼生長和發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]，尤其體現(xiàn)在軟骨的形成和骨骼的發(fā)育作用上[9]。同時，F(xiàn)GF-18與軟骨和骨的修復(fù)和重構(gòu)有關(guān)，有望成為OA的靶向治療藥物。

1 FGF-18的調(diào)控通路及影響因素

1.1 FGF-18激活A(yù)TK及ERK調(diào)控通路 FGF-18通過與其內(nèi)皮細胞上的成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)-3結(jié)合激活A(yù)KT和ERK通路(見圖1)[10]。Yao等[11]通過小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射FGF-18，利用免疫印記實驗后發(fā)現(xiàn)FGF-18通過磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)-AKT信號傳導(dǎo)促進了OA軟骨細胞的增殖。同時發(fā)現(xiàn)FGF-18以劑量依賴的方式，通過PI3K信號促進軟骨細胞的遷移。另一方面FGF-18通過PI3K-AKT信號負向調(diào)控白細胞介素(interleukin，IL)-1β誘導(dǎo)細胞凋亡，并進一步說明了FGF-18在早期治療關(guān)節(jié)炎方面具有明顯的研究意義。Chen等[12]通過化學合成FGF-18siRNA轉(zhuǎn)染H460細胞后發(fā)現(xiàn)，在48 h內(nèi)不同濃度的FGF-18顯著促進H460細胞的增殖，并且證實了FGF-18通過ERK和p38信號傳導(dǎo)的同時，增加G0/G1期和S期的細胞達成增殖。Yu等[13]通過細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-18通過調(diào)節(jié)ERK/c-Myc信號通路，促進了MDA-MB231細胞的增殖，并通過增加G0期細胞的比例調(diào)節(jié)細胞增殖。Zhai等[14]利用體外細胞培養(yǎng)并用噻唑藍法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)檢測時發(fā)現(xiàn)40μg/mL劑量的FGF-18與對照組相比在72 h增強了MC3T3-E1細胞41%的活力，進一步發(fā)現(xiàn)第7天時該劑量顯著減少了MC3T3-E1細胞中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性。同時，F(xiàn)GF-18抑制了MC3T3-E1細胞中成骨細胞相關(guān)基因的表達和MC3T3-E1細胞中的礦物沉積。另一方面，F(xiàn)GF-18對MC3T3-E1細胞的治療增加了ERK和磷酸化-ERK的蛋白表達水平，激活了ERK信號通路。綜上所述，F(xiàn)GF-18可能通過ERK信號通路抑制MC3T3-E1的分化和礦物沉積。Xu等[15]使用MTT法發(fā)現(xiàn)融合Halo-FGF-18能夠有效刺激NIH3T3細胞的增殖，并且呈劑量依賴性。更進一步發(fā)現(xiàn)Halo-FGF-18的作用機制不僅局限于NIH3T3細胞，其對ATDC5細胞也具有明顯的增殖效應(yīng)，并在促進增殖的同時可以通過調(diào)節(jié)ERK1/2信號定向調(diào)節(jié)ATDC5細胞的分化過程，間接說明了FGF-18可能作為一種促進軟骨生長的新藥物。

圖1 ERK通路和AKT通路流程圖

1.2 影響FGF-18的上游核酸結(jié)構(gòu) 關(guān)節(jié)炎的易感性可能與FGF-18有關(guān)，一項包括2 556例的單核苷酸多態(tài)性基因標記關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)FGF-18的遺傳多態(tài)性與膝關(guān)節(jié)OA的風險顯著相關(guān)[16]。Wang等[9]分析20例患者關(guān)節(jié)液后發(fā)現(xiàn)，對比無軟骨損傷的關(guān)節(jié)液微小RNA(micro RNA，miR)-195顯著增加的同時伴隨著FGF-18的顯著減少。進一步發(fā)現(xiàn)通過利用抑制劑轉(zhuǎn)染下調(diào)miR-195可以促進軟骨細胞的增殖和Ⅱ型膠原蛋白αI鏈的表達。Liu等[17]通過轉(zhuǎn)基因雜交敲除細胞信號傳導(dǎo)抑制劑(suppressor of cytokine signaling，SOCS)-3小鼠后發(fā)現(xiàn)，SOCS-3的過度表達降低了FGFR-3的表達并且伴隨著絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號的減弱。一般情況下，F(xiàn)GFR-3在HEK293T細胞中的表達增加了FGF-18的MAPK磷酸化，因此SOCS-3通過調(diào)節(jié)FGFR-3依賴于FGF-18的MAPK信號在骺板軟骨細胞增殖中發(fā)揮潛在作用。Wang等[18]分析了1 527例基因綜合表達后發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)炎的患者中miR-21-5p存在過度表達，進一步通過實驗發(fā)現(xiàn)敲除miR-21-5p的小鼠關(guān)節(jié)軟骨的骨折出現(xiàn)更大程度的破壞，并且通過熒光素酶報告分析證實FGF-18是miR-21-5p的直接靶點。

1.3 影響FGF-18的體外分子結(jié)構(gòu) Imamura等[19]使用膠原蛋白膜(collagen membranes，CM)聯(lián)合FGF-18誘導(dǎo)骨再生時發(fā)現(xiàn)對比單一CM，miR-133a的表達顯著降低了37%～64%，miR-135a的表達顯著降低了41%～50%。并且通過評估ALP活性，證實了CM聯(lián)合FGF-18對MC3T3-E1細胞成骨分化的生物學作用。Yoshimura等[20]通過體外細胞實驗利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)和western blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)Nymphaeol-C使FGF-18的Wnt通路中的β-catenin降低了38%，并進一步發(fā)現(xiàn)Nymphaeol-C顯著降低了磷酸化ERK蛋白的含量，說明了Nymphaeol-C抑制FGF-18的表達，并影響FGF-18相關(guān)信號。Shu等[21]利用敲除了小鼠硫酸乙酰肝素基因并人工制造關(guān)節(jié)炎后發(fā)現(xiàn)，敲除基因的小鼠軟骨細胞中FGF-18等蛋白表達顯著降低。雖然有顯著的關(guān)節(jié)軟骨保護，但突變小鼠軟骨下骨量并沒有顯著增加，相同的是突變小鼠骨生理體積顯著降低。可以說明的是硫酸乙酰肝素在指導(dǎo)創(chuàng)傷后OA的發(fā)展中具有重要作用，進一步提示可能通過正向調(diào)控FGF信號來指導(dǎo)OA的轉(zhuǎn)歸，更進一步得出FGF-18可以促進早期軟骨形成、軟骨細胞成熟和關(guān)節(jié)組織的成骨。

2 FGF-18的體外細胞實驗

2.1 FGF-18對軟骨細胞的增殖 FGF-18的生物活性與軟骨細胞增殖、炎癥減少和退行性過程有關(guān)，主要靶向細胞為軟骨細胞和成骨細胞[22]，并且主要增殖對象為蛋白聚糖，糖胺聚糖及Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白。Shu等[23]利用體外培養(yǎng)牛髖、膝關(guān)節(jié)細胞發(fā)現(xiàn)FGF-18在培養(yǎng)21 d時可顯著增大軟骨中微質(zhì)量顆粒，并明顯促進軟骨的發(fā)生。同時相比較Ⅱ型膠原蛋白，F(xiàn)GF-18對于Ⅰ型膠原蛋白的生長具有顯著促進作用。Müller等[24]利用體外培養(yǎng)牛軟骨細胞發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過100 μg/mL FGF-18處理實驗組中細胞數(shù)量較對照組高了3.6倍，并顯著增加了糖胺聚糖的含量。并且通過比較發(fā)現(xiàn)FGF-18是促進細胞增殖量最高的分子，但隨之帶來強烈的增殖可能是以犧牲基質(zhì)的產(chǎn)生為代價來實現(xiàn)的。H?ckel等[25]利用牛細胞體外培養(yǎng)經(jīng)FGF-18處理后發(fā)現(xiàn)，蛋白聚糖和糖胺聚糖較對照組具有顯著的提高，并進一步發(fā)現(xiàn)相關(guān)的DNA的表達及受體的表達較對照組也出現(xiàn)了顯著的提高。然而，針對牛細胞和人細胞組間蛋白聚糖和糖胺聚糖的含量無明顯統(tǒng)計學差異，證明FGF-18對細胞的種類不做區(qū)分。Frerker等[26]利用體外人軟骨細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，100 μg的FGF-18可以顯著提高mRNA COL1A1水平，但是其中膠原蛋白的增加量明顯不及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-2。Gigout等[27]利用體外培養(yǎng)豬軟骨細胞發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-18處理單層培養(yǎng)基時刺激了細胞增殖和Sox9的表達，另一方面在3D培養(yǎng)基FGF-18增加了產(chǎn)生基質(zhì)的軟骨細胞的數(shù)量。兩個培養(yǎng)基中FGF-18都增加了Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的含量和細胞外基質(zhì)的容量。

2.2 FGF-18對軟骨細胞分化的干預(yù) FGF-18促進軟骨細胞增殖的同時，通過抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的表達來定向刺激軟骨細胞的分化。Huang等[28]利用體外培養(yǎng)脂肪源性干細胞發(fā)現(xiàn)添加FGF-18刺激了其與轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β3的軟骨發(fā)生，并進一步發(fā)現(xiàn)FGF-18和TGF-β3對脂肪源性干細胞的軟骨源性分化有協(xié)同作用。Chen等[29]利用體外培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細胞RNA測序分析表明，與中心軟骨相比，軟骨樣薄膜中人誘導(dǎo)的多能干細胞透明軟骨組織顆粒FGF-18的表達更高，并且培養(yǎng)中加入FGF-18可以加速人誘導(dǎo)多能干細胞——軟骨細胞的整合，這有助于實現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨損傷患者的再生治療。

3 FGF-18治療OA的臨床試驗

FGF-18的體外及動物實驗提示該藥物具有臨床應(yīng)用的可能，并且已經(jīng)進入臨床試驗階段。本文列舉了近年來的臨床試驗研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-18激活軟骨細胞的增殖系統(tǒng)后，增加了膝關(guān)節(jié)軟骨的厚度。Sprifermin是一種潛在的重組人FGF-18抗關(guān)節(jié)炎的藥物[30]。既往動物實驗中，100 μg劑量的Sprifermin能有效降低軟骨的流失并且增加軟骨細胞的增殖[31]。一項550例多中心參與的隨機對照試驗表明，與安慰劑組相比，膝關(guān)節(jié)MRI上關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射2年的Sprifermin的患者軟骨厚度具有明顯的增加[32]。在人工及自動化測量雙重驗證下，脛骨的內(nèi)外側(cè)中心、股骨的外側(cè)中心對比安慰劑組均有顯著的軟骨厚度增加。兩種獨立的定量圖像分析方法證明了相同的結(jié)果，并驗證了Sprifermin可以有效減少膝關(guān)節(jié)軟骨流失。一項474例大型多中心隨機對照試驗發(fā)現(xiàn)，試驗組1(每6個月口服Sprifermin 100 μg)、試驗組2(每12個月口服Sprifermin 100 μg)對比安慰劑組膝關(guān)節(jié)軟骨厚度具有明顯的增加[33]。另一方面試驗組3(每6個月口服Sprifermin 30 μg)與安慰劑組膝關(guān)節(jié)軟骨厚度差異無統(tǒng)計學意義，且3個試驗組都出現(xiàn)了不同程度的并發(fā)癥，其中最常見的為關(guān)節(jié)疼痛和背部疼痛。可以證明的是，口服不同劑量的Sprifermin可以增加患者軟骨厚度，但目前尚不清楚對關(guān)節(jié)軟骨厚度的增加是否會降低膝關(guān)節(jié)置換術(shù)使用率和延遲膝關(guān)節(jié)置換術(shù)時間的風險。Roemer等[34]的一項隨機對照試驗通過觀察2年的Sprifermin的療效后，其對軟骨形態(tài)變化和骨髓疾病改善的呈現(xiàn)積極的影響。但是對于全膝關(guān)節(jié)骨生理差異、半月板半脫位的治療及延緩半月板的退化方面，應(yīng)用關(guān)節(jié)腔內(nèi)連續(xù)3次注射30 μg和100 μg的Sprifermin對安慰劑組差異無統(tǒng)計學意義，這可能與螺旋纖維蛋白的作用機制有關(guān)。通過前期的實驗Sprifermin已被證明是一種合成代謝藥物[35]，在實現(xiàn)軟骨細胞增殖的同時使軟骨細胞產(chǎn)生更透明清亮的細胞外基質(zhì)[36]。Sprifermin在增加軟骨厚度的同時減小了軟骨的流失[37]，30 μg劑量和100 μg劑量的Sprifermin對比安慰劑組在軟骨流失方面差異有統(tǒng)計學意義。并進一步發(fā)現(xiàn)，每6個月30 μg、每6個月100 μg、每12個月100 μg劑量組在軟骨增厚方面對比安慰劑組差異有統(tǒng)計學意義，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系，并且與注射的腔隙具體部位無關(guān)。Eckstein等[38]包含378例的一項大型隨機對照試驗，連續(xù)每6個月關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Sprifermin 100 μg，從第3年開始到第5年西大略湖麥克馬斯特大學(Western Ontario McMaster Universities，WOMAC)評分對比安慰劑組出現(xiàn)明顯的提升。在并發(fā)癥方面，關(guān)節(jié)痛是應(yīng)用Sprifermin最主要的臨床癥狀，但是頻繁出現(xiàn)的不良事件和并發(fā)癥中約79%與治療無關(guān)，可以充分說明Sprifermin作為治療膝關(guān)節(jié)炎潛在疾病修飾藥物的安全性與可靠性。Sprifermin作為增加軟骨厚度且可以減少軟骨流失的一種藥物，間接說明其改變了軟骨的結(jié)構(gòu)，可以作為治療膝關(guān)節(jié)炎的潛在疾病修飾藥物。Roemer等[39]的一項隨機對照試驗發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射100 μg Sprifermin劑量組對比安慰劑組在1年后股骨、髕骨關(guān)節(jié)中心的軟骨惡化的速度明顯的減弱，同時骨髓病變在藥物治療6個月后對比安慰劑組差異有統(tǒng)計學意義。然而，骨生理學、半月板病理學、關(guān)節(jié)積液等方面差異無統(tǒng)計學意義，這也間接說明了藥物對關(guān)節(jié)內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的潛在影響。Lohmander等[40]的一項192例的大型隨機對照實驗發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Sprifermin能有效改善股骨、脛骨關(guān)節(jié)左側(cè)中心軟骨厚度，并對Sprifermin有劑量依賴效應(yīng)。同時，100 μg劑量組相比安慰劑組能有效減少股骨、脛骨關(guān)節(jié)左側(cè)中心的關(guān)節(jié)間隙狹窄，并顯著改善患者的疼痛情況。在藥物安全性方面，沒有發(fā)現(xiàn)明顯安全隱患，并且各劑量組與安慰劑組并發(fā)癥發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義(見表1)。

表1 FGF-18臨床試驗

4 小 結(jié)

FGF-18是參與胚胎生長發(fā)育過程中的重要因子，并對軟骨細胞增殖、炎癥減少和退行性過程有著積極的作用。此外FGF-18通過ERK和AKT信號通路，增加了軟骨細胞中Ⅰ型、Ⅱ型膠原蛋白和糖胺聚糖的含量，并顯著增加并重組了細胞外基質(zhì)。另一方面，F(xiàn)GF-18在顯著增加軟骨細胞數(shù)量的同時，亦干預(yù)了軟骨細胞的分化過程，顯著抑制了MMP的表達，誘導(dǎo)干細胞向軟骨細胞表達。FGF18作為潛在的治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物，能明顯減少關(guān)節(jié)內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨流失，增加關(guān)節(jié)內(nèi)中心軟骨厚度，同時擁有較少的藥物副作用。因此，針對骨關(guān)節(jié)炎的治療和改善預(yù)后，F(xiàn)GF-18可以作為一種潛在疾病修飾型抗關(guān)節(jié)炎藥物。