不同品種馬鈴薯的RAPD分析

郭曉麗，劉芯瑜，劉思萌，馬志蕊，左 亮，張 旭，羅 博

(衡水學院 生命科學系，河北 衡水 053000)

1 引言

在我國，馬鈴薯大部分最初都是引自歐洲的四倍體栽培種，經過多年的培育分支出很多不同品種。但由于親緣關系較近，從而在很大程度上制約了馬鈴薯產業的發展。為了培育優良的馬鈴薯品種，推動馬鈴薯產業發展，對不同馬鈴薯品種間的親緣關系進行分析顯得尤為重要。

隨機擴增多態性DNA(RAPD技術)，又稱任意引物PCR，是通過PCR技術對要檢測的基因組序列大量的擴增后進行多態性分析的一種分子技術。它的原理是通過提取待測物種的DNA后，將其作為模板，利用隨機引物，在耐熱DNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料進行PCR擴增，經電泳分離后用紫外透視儀檢測其多態性。RAPD標記技術簡單成熟，其擴增的條帶多態性豐富，容易找到近緣種間的遺傳物質差異[1,2]。目前RAPD技術已廣泛應用于多種作物的品種鑒定及親緣關系分析中[3]。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

7個馬鈴薯品種：大西洋、費烏瑞它、麗薯6、興佳2、冀張薯12、黑玫瑰，荷14，由河北省農科院旱作農業研究所提供。

2.2 試驗方法

2.2.1 馬鈴薯的培養

選取不同品種長勢較好的馬鈴薯塊莖，洗凈后切取適量大小，用0.1%氯化汞消毒5～10 min，并蒸餾水沖洗3次。放于鋪有濾紙的培養皿上，加入適量蒸餾水，待馬鈴薯長出新葉后將蒸餾水換成營養液繼續培養，馬鈴薯長出2～3片新葉后，摘取冷凍保存。

2.2.2 馬鈴薯基因組DNA的提取及檢測

利用植物基因組總DNA提取試劑盒(上海生工)對不同品種的馬鈴薯葉片進行DNA提取。采用分光光度計法分析DNA的濃度和純度。

2.2.3 RAPD-PCR擴增

配置PCR反應體系(10 μL)：DNA 2 μL、dNTP 1 μL、buffer 1 μL、Primer 0.5 μL、TaqE 0.1 μL、ddH2O 5.4 μL。擴增程序：變性94 ℃，5 min；37 ℃，1 min，72 ℃，1.5 min，45個循環。將經過PCR擴增后的產物進行電泳，對擴增片段的分離進行拍照分析。

2.2.4 數據處理與分析

從各樣品在不同引物中篩選出條帶清晰的圖片。標記每個樣品在各引物中出現的條帶數，并以某個擴增片段出現記錄為“1”，未出現記錄為“0”，并整理成Excel，經NTedit檢驗無誤后，將其導入NTSYS軟件程序，并進一步得出聚類分析圖。

3 結果與分析

3.1 基因組DNA的測定

將提取到的7個不同品種馬鈴薯的基因進行稀釋，分別在260 nm和280 nm條件下進行檢測并對檢測結果進行計算分析。結果如表1所示，“大西洋”中混有大量RNA，其他6個品種均混有少量蛋白質。由于RNA和蛋白質在后續的擴增中對結果影響不大，故可繼續開展后續PCR擴增。

表1 不同品種馬鈴薯DNA的OD值及濃度

3.2 RAPD-PCR擴增檢測

采用20種隨機引物對7個馬鈴薯樣品進行PCR擴增后發現，不同樣品DNA在不同引物下擴增的情況有較大差異(表2)。S4、S11這2種引物對7種馬鈴薯均擴增出了條帶，S16、S20沒有條帶擴增出來，剩余的引物只對個別品種擴增出了條帶，并且條帶數較少。每個引物擴增單一品種馬鈴薯的條帶數基本在0～5條之間，而差異性的條帶在0～3條之間，從而說明了不同馬鈴薯品種之間存在條帶多樣性。由于7個不同品種的馬鈴薯在篩選出的10個引物中分別擴增出多個條帶，且可以明顯看到條帶之間具有差異性即多態性，進一步說明它們之間具有遺傳多樣性。

表2 引物S1-S20擴增條帶差異

3.3 馬鈴薯品種間的遺傳聚類分析

根據PCR擴增結果，利用聚類分析軟件NTSYS進行分析，結果如表3和圖1所示。從表3可見：麗薯6與冀張薯12之間的遺傳相似系數最大(0.757)，荷14與黑玫瑰之間的相似系數最小(0.405)。利用聚類分析軟件NTSYS對整理的數據加以處理，得到樹狀分支圖。經過分析后，可將7個不同品種分為3類：大西洋、興佳2、麗薯6、冀張薯12、黑玫瑰，聚為A類；費烏瑞它，聚為B類；荷14，聚為C類。A類中不同馬鈴薯品種之間的遺傳相似系數為0.541～0.757；費烏瑞它和荷14，即B類和C類聚為一類，費烏瑞它與其他品種之間的遺傳相似系數在0.486～0.649，荷14與其他品種之間的遺傳相似系數0.405～0.595。A類、B類較C類的遺傳距離大，變異程度也較大，親緣關系較遠，相比之下更適宜培育優良的馬鈴薯品種。而C類的遺傳距離則小些，存在變異性，但變異程度較小，親緣關系較近，不適宜用來育種。

表3 不同馬鈴薯品種的相容關系數

4 討論

分子標記是繼形態標記(株高、粒色、穗長、果色、千粒重等)、細胞標記(染色體核型與帶型)、生化標記(同I酶和貯藏蛋白)之后發展起來的一種新的更為理想的遺傳標記形式，近年來發展十分迅速。

2007年，田國奎等學者利用RAPD技術對克新系列馬鈴薯品種進行了遺傳多態性分析，證明了RAPD技術適用于分析馬鈴薯遺傳多樣性，指導馬鈴薯育種實踐中的親本組配。李鳳云等學者利用RAPD技術與AFLP技術對19份馬鈴薯品種進行遺傳多樣性分析，證明兩種方法均適用于馬鈴薯品種的遺傳多態性分析。其中RAPD技術較適用于分析品種親緣關系；AFLP技術更適用于品種鑒定。2010年，張永平等學者運用RAPD技術對四川省馬鈴薯地方品種與栽培品種之間進行了遺傳關系的探討，評價了其在遺傳研究與育種上的利用價值，指導雜交親選配。

在眾多的DNA分子標記中(RFLP、AFLP、SSR、RAPD、SCAR等)，RAPD標記技術以其靈敏度高、易檢測、操作簡單方便、安全快捷等特點，一開始就受到生物學家的高度重視，在短短的幾年時間內，已經廣泛用在多種作物的親緣關系分析、品種鑒別、分類、基因定位、種子純度分析、以及染色體組基因的分子標記等方面。今后可以利用RAPD技術對多種作物的親緣關系進行初步的分析。