錦雞兒花及根中酚性物質的含量及其抗氧化作用的比較研究

劉明秀，鄒秋萍，劉紹科，何 瑞，付康敏，李艷平

(云南中醫藥大學 中藥學院、云南省南藥可持續利用重點實驗室，云南 昆明 650500)

0 引言

錦雞兒(Caraganasinica(Buc'hoz) Rehder)為豆科錦雞兒屬植物[1]，異名金雀花、金鵲花、陽雀花、黃雀花、斧頭花等。主要分布于新疆、浙江、河北、山東、江西、江蘇、四川、湖南、河南、福建、貴州和云南等地[2]。據《藥用植物辭典》記載，該植物的根、花等部位均可入藥[3]。錦雞兒在民間用作滋補強壯藥，因此也有地區稱之為土黃芪或直接充作黃芪用[4]。對該植物化學成分的研究表明錦雞兒中主要有三萜、黃酮、生物堿、二苯乙烯、苯丙素、有機酸類化合物[5～7]，其藥理作用包括降壓、抗炎、免疫抑制、血栓抑制、平喘、抑菌、抗腫瘤及鎮痛作用等[8]。錦雞兒花營養成分豐富，是天然無污染的食物。花及花蕾洗凈后素炒、炒雞蛋、炒肉絲、燉豬肉及蒸雞蛋，烹制許多種菜肴，風味獨特，色味俱佳[9]。除食用價值，錦雞兒花還具有祛風活血，止咳化痰的作用，可用于頭暈耳鳴，肺虛咳嗽，小兒消化不良[10]。而錦雞兒根又名白心皮、金雀花根、土黃芪。《中華本草》記載: 錦雞兒根味甘、辛、微苦，性平，歸肺、脾經[11]，在民間被作為治療虛癥、血管性高血壓、白斑、瘀傷和挫傷的草藥[12]。錦雞兒根中所含的化學成分主要為甾醇、皂苷以及二苯乙烯低聚物，生理活性顯著[13]。盡管錦雞兒花和根具有很高的食用和藥用價值，在中國的大部分地區仍然僅僅將其用于防風固沙以及牲畜的飼料，因此，對于錦雞兒的二次開發具有重要的意義。

隨著我國人口老齡化的加快，癌癥和一些老年性疾病的發病率和死亡率日益增多，這些疾病多與體內的自由基氧化反應有重要關系，因此，尋找一種新穎、有效的自由基清除劑即抗氧化劑來預防和減少老年疾病的發生、減緩人體的衰老過程意義重大[14]。而植物來源的多酚以及黃酮類化合物多具有很強的抗氧化功效[15]。結合前期對錦雞兒的文獻調研，前人對錦雞兒的化學成分，栽培技術以及活性方面做了相關研究，且在抗炎，抗腫瘤等方面有良好的活性，在抗氧化方面也有一定研究意義。筆者實驗首次研究錦雞兒根及花中酚性物質含量以及抗氧化活性，以及它們所表現出來的對氧自由基的清除能力，為抗氧化產品開發提供理論支持。因此，筆者試驗以錦雞兒花及根為原料，分別以85%乙醇回流提取其活性成分，后經氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取獲得不同萃取部位，測定各萃取部位的總黃酮、總多酚含量，并采用DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和鐵離子還原能力3種方法評價其抗氧化活性，以期更好的對錦雞兒進行綜合分析評價，為錦雞兒資源的開發利用提供新的理論依據及方向。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

錦雞兒花及根樣品各500g采購于貴州省銅仁市野生藥材批發市場；DPPH(1, 1-二苯基-2-苦基肼基自由基)、TPTZ、ABTS、蘆丁標準品、沒食子酸標準品購買于Sigma-Aldrich公司；福林酚試劑、水溶性維生素E(Trolox)購買于默克公司；60%乙醇、5% NaNO2、10% Al(NO3)3、4% NaOH、20% NaCO3、甲醇、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、FeCl3、FeSO4·7H2O、乙酸鈉、冰醋酸、濃鹽酸、過硫酸鉀、無水乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設備

紫外-可見分光光度計(UV-5100BPC型，上海元析儀器有限公司)；電子天平(型號 AL204，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；恒溫水浴鍋(HH-4型，金壇市科儀儀器有限公司)；高速臺式離心機(TGL-20B型，上海安亭科學儀器廠)；高速多功能粉碎機(Q-250B3型，上海冰都電器有限公司)；低溫冷卻液循環泵(DLSB-5L/10型，鞏義市予華儀器有限責任公司)，真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限責任公司)；旋轉蒸發儀(Hei-VAP型，德國Heidolph)；電熱鼓風干燥箱(WGL-125B，天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 錦雞兒花及根不同極性樣品的制備 取錦雞兒花及根粗粉各400g，加入85%乙醇回流提取3次，提取液濃縮得浸膏。將所得浸膏分散于水中，依次加入氯仿、乙酸乙酯、正丁醇溶劑各萃取3次，得到錦雞兒花及根的氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相的萃取液，減壓蒸發得各萃取相樣品浸膏，備用。

1.3.2 總多酚含量的測定 采用福林-酚(Folin-Ciocalteu)比色法測定各樣品的總多酚(total phenolic content，TPC)含量。取0.6 mL不同濃度的樣品，加入0.4 mL去離子水及0.5 mL福林酚試劑，充分搖勻，靜置1 min；加入1.5 mL 20% Na2CO3溶液及去離子水定容至10.0 mL，搖勻，于70℃水浴加熱10 min，冷卻后于765 nm下測定吸光值。在同樣條件下使用不同濃度沒食子酸標準溶液(0.5 mg/mL)制備標準曲線，計算錦雞兒不同極性部位總多酚含量，將其表示為每1 g 提取物的沒食子酸當量 ( mg GAE/g 提取物) 。

1.3.3 總黃酮含量的測定 吸取樣品溶液1.2 mL于10 mL容量瓶中，加入3.8 mL 60 %乙醇和0.3 mL 5% NaNO2，充分搖勻，靜置8 min，加入0.3 mL 10 % Al(NO3)3和4.0 mL 4% NaOH溶液，用60 %乙醇定容至10 mL。靜置12 min，于510 nm處測定吸光度。在同樣條件下使用不同濃度蘆丁標準溶液(0.5 mg/mL)制備標準曲線，計算錦雞兒不同極性部位總黃酮含量，將其表示為每1 g 提取物的蘆丁當量 ( mg RU/g 提取物) 。

1.3.4 抗氧化活性的測定 清除自由基即可阻斷氧化反應，用DPPH法、Fe3+還原法、ABTS法測定錦雞兒花及根各組分清除自由基的能力。用抑制率(K)表示清除自由基的能力大小，抑制率越大，清除自由基的能力越強，即抗氧化性越強。

(1)錦雞兒花及根中不同極性萃取物對DPPH自由基的清除能力。參照文鏡等[16]測定DPPH·自由基清除能力的方法和原理。精確稱取DPPH 3.94 mg，用甲醇定容至10 mL，配成1 mmol/L的DPPH母液，測定時，用甲醇稀釋10倍，配成0.1 mmol/L的DPPH反應液。取樣品0.5 mL(稀釋為一定濃度梯度的樣液)于5 mL離心管中，加入2 mL 0.1mmol/L DPPH甲醇溶液混勻，暗處放置并不斷震蕩30 min，于517 nm處測定吸光值。使用公式 [A0- (AX- AX0)]/A0× 100%計算各樣品的DPPH·自由基清除率,式中A0是空白對照組吸光值(0.5 mL甲醇+2 mLDPPH)，AX是樣品吸光值(0.5 mL樣液+2 mLDPPH)，AX0是樣品對照組吸光值(0.5 mL樣液+2 mL甲醇)。

(2)錦雞兒花及根不同極性萃取物ABTS+清除能力的測定。參照Garzón G A等[17,18]測定ABTS+清除能力的方法和原理。預先配置ABTS+自由基儲備液：將5 mL ABTS (7 mmol/L)與88 μL過硫酸鉀(40 mmol/L)充分混勻后，室溫下避光放置12～16 h。使用前，用無水乙醇將ABTS+自由基儲備液進行稀釋從而得到ABTS+自由基工作液，要求該工作液在30℃下，734 nm下吸光值為0. 70 ±0. 02(用無水乙醇調零)，將該工作液置于30℃下保存備用。測定時，取0. 5 mL不同濃度的樣品溶液，加入4 mL ABTS+自由基工作液，混合均勻，于30℃水浴加熱6 min，于30℃、734 nm條件下測其吸光值。使用公式 [A0- (A2- A1)] A0× 100% 計算各樣品的ABTS+自由基清除率,式中A0是空白對照組吸光值(0.5 mL無水乙醇 + 4.0 mL ABTS+)，A2是樣品吸光值(0.5 mL樣品 +4.0 mL ABTS+)，A1是樣品對照組吸光值(0.5 mL樣品 + 4.0 mL無水乙醇)。用Trolox對照溶液制備標準曲線。

(3)錦雞兒花及根不同極性萃取物的總還原能力的測定。鐵離子還原能力的測定采用鐵離子還原法(ferric ion reducing antioxidant power，FRAP)，預先配制FRAP工作液：將乙酸鈉緩沖液(0.30 M、pH 3.6)、TPTZ(10 mM)和FeCl3(20 mM)按照體積比為10∶1∶1的比例混合均勻，于37℃下水浴備用。測定時，取0.5 mL不同濃度梯度樣品溶液，加入4.5 mL預熱的FRAP工作液，混合均勻后于37℃水浴加熱10 min，于593 nm下測其吸光值。用FeSO4對照品溶液制備標準曲線。

2 數據統計分析

所有實驗均重復測定3次，使用Origin2019軟件對數據進行統計學分析及作圖。所有實驗結果的形式表示為：三組平行實驗的平均值(n = 3)± 標準偏差(SD)，并通過單因素方差分析( one-way ANOVA) 對所有數據進行顯著性分析，P<0. 05 認為具有顯著性差異，IC50值和EC50值均用 SPSS Statistics25軟件進行計算。

3 實驗結果與分析

3.1 錦雞兒花及根中總多酚、總黃酮含量

多酚、黃酮類化合物在自然界中分布廣泛，并且都具有較強的抗氧化活性。兩類化合物的極性范圍較寬，可以從不同極性的溶劑中萃取得到。因此，從不同極性部位萃取得到的總多酚、總黃酮含量的種類和數量也會存在一定的差異。錦雞兒及根中不同極性萃取部位的總多酚、總黃酮含量結果分別見表1、表2、圖1、圖2。

由表1、表2和圖1可以得出，錦雞兒花及根中均含有一定量的多酚類化合物，其多酚含量范圍在76.60～564.94 mg/g。錦雞兒花及根的不同極性溶劑提取物中，多酚含量均為氯仿提取物>乙醇粗提物>水相。錦雞兒花及根中總黃酮含量范圍在5.31～188.00mg/g。錦雞兒花不同溶劑提取物中，總黃酮含量為氯仿提取物>乙酸乙酯提取物>水相。而根中總黃酮含量為乙酸乙酯提取物>乙醇粗提物>水相。

表1 錦雞兒花各樣品中總多酚、總黃酮的含量

表2 錦雞兒根各樣品中總多酚、總黃酮的含量

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3.2 抗氧化活性分析

3.2.1 錦雞兒花及根提取物對DPPH·自由基清除作用的比較 清除DPPH·自由基的能力通常以50%清除率時的樣品質量濃度(mg/mL)，即IC50值來衡量，IC50值越小，則表示樣品的抗氧化活性越強。經不同溶劑萃取錦雞兒花及根的DPPH·自由基清除活性結果見表3。

由表3和圖3可以看出，錦雞兒花及根不同提取物對DPPH·自由基均有一定的清除能力。錦雞兒花不同極性提取物中，抗氧化活性強弱順序：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位。錦雞兒根不同極性提取物中，抗氧化活性強弱順序：正丁醇部位>乙酸乙酯部位>水部位。

表3 各樣品清除DPPH·自由基的IC50值

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3.2.2 錦雞兒花及根提取物對ABTS+自由基清除作用的比較 ABTS在適當的氧化劑作用下氧化成綠色的ABTS+，在抗氧化物存在時ABTS+的產生會被抑制，通過在最大吸收波長734 nm處檢測吸光度的變化來評價自由基被清除的情況，從而評價試驗樣品抗氧化能力的大小[19]。經不同極性溶劑萃取錦雞兒花及根的ABTS+自由基清除活性結果見表4，其抗氧化活性強弱也以 IC50值來表示。

由表4和圖4可以看出錦雞兒花及根不同提取物對ABTS+自由基均有一定的清除能力，且錦雞兒根的乙酸乙酯提取部位對ABTS+自由基清除能力略高于陽性對照Vc。在花不同極性提取物中，抗氧化活性強弱順序：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位。錦雞兒根不同提取物中，抗氧化活性強弱順序為：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位。

3.2.3 錦雞兒花及根提取物對鐵離子還原能力的比較 用EC50值來衡量樣品鐵離子還原能力的強弱，EC50值表示還原能力達到0.5 mmol/L FeSO4·7H2O時所對應的樣品質量濃度(mg/mL)，EC50值越小則表示樣品的還原能力越強，即抗氧化活性越高。經不同極性溶劑萃取錦雞兒花及根的鐵離子還原能力結果見表5。

表4 各樣品清除ABTS+自由基的IC50值

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表5和圖5可以看出，錦雞兒花及根不同提取物對鐵離子均有一定的還原能力，陽性對照組Vc的鐵還原能力明顯優于各萃取物。錦雞兒花不同極性提取物中，抗氧化活性強弱順序：正丁醇部位>氯仿部位>乙酸乙酯部位。錦雞兒根不同極性提取物中，抗氧化活性強弱順序：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位。

表5 各樣品還原鐵離子能力的EC50值

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3.3 錦雞兒總酚、總黃酮與抗氧化能力的相關性

對各組分總多酚和總黃酮含量和3種抗氧化評價方法的IC50值和EC50值進行相關性分析，總多酚和總黃酮含量越高抗氧化能力越強所對應的IC50值和EC50值越小，故數據應為負。錦雞兒總酚、總黃酮與抗氧化能力的相關性如表6、表7所示，結果顯示，錦雞兒花中氯仿部分總黃酮含量與ABTS+清除率呈顯著正相關(p<0.05)；錦雞兒根中乙醇粗提物的多酚含量與ABTS+清除率呈極顯著正相關(p<0.01)，而黃酮含量與ABTS+清除率呈顯著正相關(p<0.05)；錦雞兒根中氯仿部分的黃酮含量與DPPH · 清除率呈顯著正相關(p<0.05)，錦雞兒根中水部分的黃酮含量與DPPH · 清除率呈極顯著正相關(p<0.01)。

表6 錦雞兒花各樣品中總多酚、總黃酮含量與抗氧化能力的相關性

表7 錦雞兒根各樣品中總多酚、總黃酮含量與抗氧化能力的相關性

4 討論

從以上實驗結果可以得出，不管是在錦雞兒花提取物中，還是在錦雞兒根提取物中，氯仿部位的多酚含量都是最高的，尤其是在錦雞兒根提取物中，氯仿部位的多酚含量達到(564.94±4.61)mg/g，是其粗提物的2.92倍。其中錦雞兒根乙醇粗提物、乙酸乙酯提取物的黃酮含量大于錦雞兒花的黃酮含量，而氯仿、正丁醇、水提取物的黃酮含量均小于錦雞兒花的黃酮含量。總的來說，總多酚含量是其黃酮含量的3.01～14.43倍左右，且極顯著。在其抗氧化能力方面，對花和根的同一極性部位而言，錦雞兒花乙酸乙酯、正丁醇、水部位清除DPPH·自由基的能力顯著高于錦雞兒根，而在氯仿提取物中，錦雞兒根清除DPPH·自由基的能力高于錦雞兒花。對錦雞兒花和根的ABTS+自由基清除能力均是乙酸乙酯和正丁醇部位最好。錦雞兒根氯仿、乙酸乙酯部位對鐵離子的還原能力高于錦雞兒花，而在正丁醇、乙醇粗提物和水部位，錦雞兒花對鐵離子的還原能力高于錦雞兒根。因此，錦雞兒不同極性提取部位均具有抗氧化活性。并將其總多酚，總黃酮含量進行相關性分析，多酚和黃酮類物質的含量對DPPH·自由基、ABTS+自由基和Fe3+還原能力清除率有一定的正相關性，但并不絕對，且普遍相關性不顯著，表明這些組分中可能存在除黃酮和多酚以外的其他抗氧化活性成分。通常情況下用無水乙醇提取出來的黃酮、多酚以及蛋白質、多糖相對較少，其活性物質及提取物的生物活性可能存在差異，故結果會存在差異[20]。氯仿易揮發，易被氧化并且極性相對較小，提取率也小，故氯仿部位所含有效化學成分相對較少[21]，因此，可能導致結果不一致性，這可能與黃酮或多酚的結構以及取代類型有關。

錦雞兒作為民間藥材具有悠久的應用歷史，錦雞兒花及根以及錦雞兒屬其它植物在抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多方面顯示出良好的治療活性，具有較高的研究價值和應用前景[22]。Cui YY 等[23]從傳統藥用植物錦雞兒中提取黃酮類化合物3,4-二羥基-8,9-亞甲二氧基-洋心果聚糖，也證實所得化合物具有較高的抗氧化活性。本次實驗證實了錦雞兒花的正丁醇和乙酸乙酯部位，根的乙酸乙酯部位具有作為天然氧化劑的可能性，這與王金梅等[24]研究結果相符；Khan AN等[25]從錦雞兒乙酸乙酯可溶部位分離得到一種新的異黃酮化合物，并對其抗氧化活性進行了評價，結果表明該異黃酮化合物也是一種有效的抗氧化劑；Jin Q等[26]從錦雞兒根乙酸乙酯水溶性提取物中分離得到了兩種新的低聚二苯乙烯類化合物以及葡萄糖苷，并對其抗氧化活性進行了評價，發現具有有效的抗氧化活性。這使得錦雞兒作為天然氧化劑的應用價值和經濟價值得到了進一步的肯定。

目前針對錦雞兒的研究，雖然得到了一些具有抗氧化能力的黃酮和低聚二苯乙烯類化合物，但利用這些化合物的全合成和結構修飾來實現天然抗氧化劑產業化生產及應用仍需要開展長期深入的工作。我們注意到，錦雞兒的經濟價值較高，也有大量的研究集中在其栽培技術上，規模化的種植和采集使得其方便易得，那么明確其不同部位的抗氧化能力，可為錦雞兒的二次開發和產業化應用提供理論基礎和科學依據。