伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因多態性研究

牛華鋒，張成東，楊雪嬌，任戰軍，王淑輝，趙永攀

(1.楊凌職業技術學院 動物工程分院，陜西楊 凌 712100；2.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 7121000；3.陜西畜牧產業試驗示范中心，陜西 涇陽 713702)

兔肉被譽為“保健肉”、“美容肉”、“益智肉”，其營養價值愈來愈被消費者認可，國內外市場需求日益增長。培育生長速度快、肉質鮮嫩、屠宰率高的肉兔品種，一直是家兔育種工作關注的熱點。肌肉生長抑制素(myostation，MSTN)，又稱為轉化生長因子8(growth differentiation factor 8,GDF-8)，屬于TGF-β超家族[1]，能夠負調控骨骼肌的生長，抑制肌肉的生長[2]。大量的研究表明，MSTN基因在哺乳動物中高度保守，MSTN基因突變或敲除后能產生“雙肌癥狀”[3～7]，過表達則會減少肌肉生長，是影響畜禽產肉性狀狀的主要功能基因之一。分子輔助育種法對于家兔育種至關重要，SNP(single nucleotide polymorphism ,SNP)是指基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列的多態性。喬西波等[8](2010)研究了9個純系肉兔及其37個雜交組合的MSTN基因，發現MSTN基因重要SNP位點突變有利于家兔體軀發育。張柯等[9]研究發現兔MSTN基因外顯子1和外顯子2的2個SNP位點(分別是194bP，445bP)，2個位點堿基突變顯著影響兔135日齡全凈膛重、屠宰率和熟肉率。筆者研究比較分析伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因重要SNP位點的基因型及分布情況，探索其對家兔產肉性狀有益的分子標記，以期為家兔分子選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗選取陜西天鑫兔業有限公司的伊拉肉兔和美系獺兔各70只(公母各35只)。心臟采血10 mL，裝入已添加2.5 mL滅菌ACD抗凝劑的離心管中，用冰盒迅速帶回實驗室，-80℃保存。采用酚-氯仿法提取基因組總DNA，-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參考http://asia.ensembl.org/ 基因庫中兔子MSTN基因外顯子Ⅰ、外顯子Ⅱ和外顯子Ⅲ序列，并用Primer5設計引物，擴增片段長度分別為577bp、749bp和668bp左右。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成。引物序列見表1。

表1 MSTN基因外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的引物序列信息

1.2.2 基因片段的PCR擴增 PCR擴增總體積為50μL，試驗所用2×Taq Master Mix來自康威世紀，由Taq DNA polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、藍色染料以及PCR穩定劑和增強劑組成，引物濃度為10pmol/μL，DNA模板濃度為100 ng/μL，PCR各物質添加量及所用擴增程序如表2。

表2 PCR擴增體系及其擴增程序

擴增產物(取5μL)用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用BIO-RAD凝膠成像系統檢測擴增結果。

1.2.3 PCR擴增產物測序 各樣本均取30μL擴增產物和20μL上下游引物，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化、測序。

1.2.4 數據統計 采用MegAlign，Chromas Application 2.3.0.0軟件對測序結果進行序列結構分析，通過序列比對和序列峰值校正，篩選出SNP位點，判斷出突變位點的基因型。用PopGene32軟件進行hardy-weinberg平衡檢驗，以及基因型頻率、等位基因頻率、雜合度和有效等位基因數等遺傳參數的計算。用PIC計算軟件計算出多態信息含量。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測MSTN外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的PCR擴增產物，結果顯示擴增產物特異性良好，其片段長度分別為668bp、749bp和577bp，片段長度符合預期，適合進行測序。瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1、圖2和圖3。

圖1 外顯子ⅠPCR擴增產物電泳檢測結果

圖2 外顯子ⅡPCR擴增產物電泳檢測結果

圖3 外顯子ⅢPCR擴增產物電泳檢測結果

2.2 PCR產物測序結果

將樣本PCR擴增產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化、測序。結果顯示在70只伊拉肉兔和70只美系獺兔MSTN基因中共發現4個SNP位點，分別位于MSTN基因序列外顯子Ⅰ的111bp處，內含子Ⅰ的234bp處，外顯子Ⅱ的338bp處和內含子Ⅱ的34bp處。外顯子Ⅲ中則未發現多態位點。

2.2.1 MSTN外顯子Ⅰ和內含子Ⅰ的測序結果 測序結果顯示，MSTN外顯子Ⅰ的SNP位于111bp處，發生C-T轉換，共發現CC基因型、CT基因型和TT基因型3種基因型(見圖4)。

圖4 MSTN外顯子Ⅰ的3種基因型

內含子Ⅰ在的234bp發現1個SNP位點，發生G-A轉換，共發現GG基因型、AA基因型和AG基因型3種基因型(見圖5)。

2.2.2 MSTN外顯子Ⅱ和內含子Ⅱ的測序結果 MSTN外顯子Ⅱ在338bp處發現1個SNP，發生T-A顛換，共發現TT基因型、AT基因型和AA基因型3種基因型(見圖6)。

測序結果顯示，MSTN內含子Ⅱ在34bp處發現1個SNP，發生C-T轉換，共發現型CC基因型、TT基因型和CT基因型3種基因(如圖7)。

圖5 MSTN內含子Ⅰ的3種基因型

圖6 MSTN內含子Ⅱ的3種基因型

圖7 MSTN內含子Ⅲ的3種基因型

2.3 遺傳多態性分析

2.3.1 MSTN基因4個SNP位點基因型頻率、等位基因頻率分析 筆者研究對伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因4個SNP位點進行了基因型頻率、等位基因頻率分別進行了分析，結果見表3～表6。

表3 MSTN外顯子Ⅰ的111bp處基因型頻率和等位基因頻率

由表3可知，伊拉肉兔和美系獺兔的MSTN基因外顯子Ⅰ的111bp處CC基因型頻率顯著高于CT基因型和TT基因型；C等位基因頻率明顯高于T等位基因頻率，是兩兔群體的優勢基因。通過Chi-square適合性檢驗，該位點各基因型頻率分布在伊拉肉兔群體中不符合hardy-weinberg平衡(P<0.05)，而在美系獺兔群體中則符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

表4 內含子Ⅰ的234bp處基因型頻率和等位基因頻率

由表4可知，伊拉肉兔和美系獺兔的MSTN基因中內含子Ⅰ的234bp處雜合子GA基因型頻率在中最高；G等位基因在伊拉肉兔群體中為優勢基因，占0.55；A等位基因在美系獺兔群體為優勢基因，占0.5143。通過Chi-square適合性檢驗，該位點各基因型頻率分布在伊拉肉兔群體和美系獺兔群體中均符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

表5 外顯子Ⅱ的338bp處基因型頻率和等位基因頻率

由表5可知，伊拉肉兔和美系獺兔的MSTN基因中外顯子Ⅱ的338 bp處雜合子TA基因型頻率最高；T等位基因頻率均略高于A等位基因頻率，為優勢等位基因。通過Chi-square適合性檢驗，該位點各基因型頻率分布在伊拉肉兔群體和在美系獺兔群體中都符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

表6 內含子Ⅱ的34 bp處基因型頻率和等位基因頻率

由表6可知，伊拉肉兔和美系獺兔的MSTN基因內含子Ⅱ的34 bp處雜合子CT基因型頻率最高；T等位基因頻率均略高于C等位基因頻率，為優勢等位基因。通過Chi-square適合性檢驗，該位點各基因型頻率分布在伊拉肉兔群體和在美系獺兔群體中均符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

2.3.2 MSTN基因4個SNP位點遺傳參數分析 本研究分析了伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因4個SNP位點遺傳參數，將MSTN基因外顯子Ⅰ的SNP位點記作A，內含子Ⅰ的SNP位點記作B，外顯子Ⅱ的SNP位點記作C，內含子Ⅱ的SNP位點記作D。由表7可以看出，伊拉肉兔中A位點的雜合度(0.171 4)和期望雜合度(0.286 1)最低，A位點有效等位基因數在這兩個家兔品種中相對較低(分別為1.396 8和1.618 2)，其他三個多態位點有效等位基因數都在1.9以上。在伊拉肉兔和美系獺兔群體MSTN的4個SNP位點(A、B、C、D)均表現為中度多態(0.25

表7 伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因各多態位點的遺傳參數

3 討論與結論

MSTN基因參與骨骼肌的分化，MSTN基因突變的動物骨骼肌肌群分布廣泛且肉質優良[10]。筆者研究在70只伊拉肉兔和70只美系獺兔MSTN基因中共發現4個SNP位點，其中外顯子Ⅰ和外顯子Ⅱ中的多態位點，與張柯等[9]的研究結果一致；外顯子Ⅲ未發現多態位點，與喬西波等[8]的研究結果一致；內含子Ⅰ和內含子Ⅱ的多態位點在家兔中首次發現，與其家兔的生長發育是否有關還需要進一步的研究。

在伊拉肉兔群體中外顯子Ⅰ的SNP位，三種基因型頻率不符合hardy-weinberg平衡(P<0.05)，其CC基因型為優勢基因型，C等位基因為優勢基因，這可能是由于C等位基因影響家兔肌肉生長。俞成浩等[10]研究發現在MSTN基因擴增片段中發現SNP位點，27只齊興肉兔和伊拉肉兔均為CC型。結合已有報道，推斷伊拉肉兔較美系獺兔生長速度快或許與此有關，即可認為伊拉肉兔在人工選育的過程中突出肉用性能的選育，強化了C等位基因的選擇，導致了該位點不符合hardy-weinberg平衡。

筆者研究在伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因除了伊拉肉兔群體中外顯子Ⅰ的SNP位點各基因型頻率不符合hardy-weinberg平衡(P<0.05)，內含子Ⅰ、外顯子Ⅱ和內含子Ⅱ的3個SNP位點各基因型頻率均符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。至于MSTN基因在動物體內發揮作用的分子機制尚不明確，但相關的研究表明，MSTN基因影響畜禽生長發育與肌肉生長。趙振華等[11]發現MSTN基因突變顯著影響優質雞肌肉生長，是雞肌肉生長主效基因之一。張柯等[9]研究發現MSTN基因SNP位點顯著影響了6個肉兔品種135日齡全凈膛重、屠宰率等。結合已有的研究，這3個SNP位點基因型頻率、等位基因頻率分布相似，是由于伊拉肉兔和美系獺兔在品種選育過程對生長速度、屠宰率等肉用指標都作為重用經濟指標。

筆者研究表明，伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因各多態位點的遺傳參數中，遺傳信息含量較高(0.25