TMB 表達水平對EGFR突變晚期NSCLC患者預后分析

高 崢，宋春青，張 穎，郭宏偉，司蓮蓮，趙麗波

(首都醫科大學大興教學醫院 腫瘤科，北京102600)

肺癌在我國發病率和死亡率均居首位，并且發病率逐年增長，患者趨年輕化，預后也較差[1-2]。原發性肺癌中約80%為非小細胞肺癌(NSCLC)，隨著致癌驅動基因如表皮生長因子受體(EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、c-ros癌基因1(ROS1)等的相繼發現，基于驅動基因的靶向治療藥物大大延長了非小細胞肺癌患者的生存期。相比西方國家，亞裔人群和我國的NSCLC患者EGFR基因敏感突變陽性率更高，達40%-50%，其中不吸煙者、女性尤高[3]。因此，EGFR是肺癌治療中最重要的靶點。一代、二代和三代 EGFR-TKI是目前EGFR 突變型IV期NSCLC患者的一線標準治療方案，可以取得較高的客觀緩解率(70%左右)和9-18個月的中位PFS，但仍有部分EGFR驅動基因陽性的患者療效及預后不佳，因此，尋求此類患者TKI治療獲益的預測因子和標記物可對臨床決策產生積極影響。

腫瘤突變負荷(TMB)是一個具有良好前景的全新生物標記物。TMB被定義為腫瘤基因組中每百萬堿基中被檢測出的，體細胞基因編碼錯誤、堿基替換、基因插入或缺失錯誤的總數。多項研究提示，高TMB患者對免疫治療應答更強，對肺癌[4]、黑色素瘤[5]等惡性腫瘤的免疫治療均有預測作用。國外部分數據顯示TMB數值的高低可能與EGFR驅動基因突變患者的預后相關，本研究采用回顧性研究，分析真實世界中晚期NSCLC患者治療前TMB的表達水平及其與EGFR突變患者的預后相關性，揭示TMB是否在靶向治療中亦存在預測作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性納入2015年1月至2021年1月在首都醫科大學大興教學醫院確診的95例初治晚期NSCLC患者。組織學分類依據世界衛生組織標準(2015年版)[6]。肺癌分期按國際抗癌聯盟(UICC)第8版TNM分期進行。研究方案經首都醫科大學大興教學醫院倫理審查委員會批準。選擇納入標準：①經原發或轉移病灶穿刺活檢或手術切除組織病理確診為肺腺癌或含腺癌成分的肺鱗癌，第8版國際抗癌聯盟分期標準為Ⅳ期；②年齡≥18歲；③含EGFR驅動基因敏感突變(19DEL或21L858R)，且一線治療給予EGFR-TKIs藥物，用藥時間至少30 d以上；④患者診斷時已行組織TMB檢測并可以獲得完整的病歷資料。主要排除標準：①合并其他原發性惡性腫瘤；②無法獲取病理組織、Ⅰ-Ⅲ期患者或合并嚴重并發癥、心肝腎等嚴重臟器功能障礙有TKI藥物治療禁忌者。截止2021年1月，共納入95例患者，其中男52例，女43例；年齡(63.69±9.37歲)；病理類型：腺癌92例，鱗癌1例，腺鱗癌2例。

1.2 方法

1.2.1EGFR-TKIs靶向治療 所有患者一線治療接受單藥EGFR-TKI治療，可選擇吉非替尼250 mg(1片)，1日1次，或鹽酸埃克替尼125 mg(1片)，1日3次，或甲磺酸奧希替尼80 mg(1片)，1日1次。直至患者腫瘤疾病進展或出現無法耐受的治療毒性。最常見的毒副作用為皮疹、腹瀉和藥物性肝損傷，NCICTCAE2級或2級以上的ALT、AST升高，NCICTCAE3級或3級以上的腹瀉、皮疹，允許暫停TKIs治療至下降至0-1級后再次應用，出現藥物相關的間質性肺疾病，重度肝損傷等重度毒性時給予終止TKI治療并更換治療方案。

1.2.2臨床資料采集 從電子病歷中提取患者的臨床和治療信息，包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤分期、病理類型、具體治療方案、無進展生存期等。根據實體腫瘤Recist 1.1版療效評價標準，通過螺旋CT或磁共振成像掃描對所有患者進行影像學評價。無進展生存期(PFS)被定義為從首次用藥到第一次疾病進展或因任何原因死亡的日期。采用門診或電話隨訪，本研究最后一次隨訪時間為2022年3月1日。

1.2.3TMB檢測 所有穿刺組織或手術切除組織離體后用中性緩沖福爾馬林固定。為保證TMB檢測結果的可靠性，要求送檢3個月以內的蠟塊組織。病理質控達標后，使用QIAGEN試劑盒從10至15張5 μm厚的腫瘤FFPE組織的未染色切片中提取基因組DNA。應用通用試劑盒KAPA Hyper Prep試劑盒進行DNA文庫制備，然后采用定制的xGen鎖定探針進行雜交富集，探測面板的設計目標是425個癌癥特異性基因，采用目標區域探針捕獲技術，在Illumina Hiseq4000 NGS平臺上擴增富集的文庫并進行NGS檢測。TMB定義為每1Mb檢測的基因組中的體細胞突變數，統計的突變包括錯義、同義、移碼、剪接位點突變，排除了EGFR和ALK等肺癌驅動基因的激酶結構域。

1.2.4統計學分析 采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用t檢驗和χ2檢驗。采用Kaplan-Meier方法對高TMB、中低TMB組的PFS進行生存分析，采用Cox比例風險模型對影響PFS的預后因素進行多因素分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TMB表達與臨床病理特征的相關性

在納入標準的95例EGFR突變的晚期NSCLC患者中，中位TMB值為5.2 muts/Mb(2.0-16.2 muts/Mb)，通過三分位法分為高TMB組(TMB>6.1 muts/Mb)、中TMB組(4.5-6.1 muts/Mb)和低TMB組(<4.5 muts/Mb)。其中高TMB組患者的ORR為59.38%(19/32)，顯著低于中、低TMB組(ORR為84.13%(53/63))，χ2值7.086，差異有統計學意義(P=0.008)。21L858R突變患者51例，TMB均值為7.026±4.076 muts/Mb，19DEL突變患者44例，TMB均值為5.336±2.004 muts/Mb，21L858R突變患者TMB表達水平高于19DEL患者，差異有統計學意義(P=0.014)。大多數人為一代TKI治療患者，其中吉非替尼組患者最多，占70.5%(67/95)，鹽酸埃克替尼組其次，占25.3%(24/95)，三代TKI均為甲磺酸奧希替尼，占4.2%(4/95)。TMB表達水平與性別、年齡、是否吸煙、病理類型均無顯著相關性(P>0.05)。

表1 TMB表達與臨床病理特征的相關性

2.2 生存分析

Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，高TMB組的中位PFS為7.2m(95%CI 4.570-9.830)，中、低TMB組患者中位PFS為11.2m，(95%CI 10.300-12.100)，兩組比較，差異有統計學意義(P=0.001)(圖1)。與19DEL突變患者相比，21L858R突變患者中位PFS更短，為9.3m(95%CI 7.665-10.935)vs 11.2m(95%CI 9.550-12.850)，但二者無明顯統計學差異(P=0.072)(圖2)。

圖1 高TMB與中、低TMB的PFS Kaplan-Meier生存曲線圖

圖2 21L858R突變患者與19DEL突變患者的PFS Kaplan-Meier生存曲線圖

2.3 影響NSCLC患者PFS的預后因素分析

對可能影響預后的臨床病理特征進行單因素和多因素回歸分析(表2)。單因素分析顯示以下3個因素與PFS有關：EGFR突變狀態(P=0.031)、吸煙(P=0.038)、TMB表達水平(P=0.001)。多因素分析顯示以下2個影響PFS的獨立預后因素：吸煙(HR=1.838，95%CI：1.072-3.151，P=0.027)、TMB表達水平(HR=2.518，95%CI：1.468-4.319，P=0.001)。

表2 影響NSCLC患者PFS的單因素和多因素分析

3 討論

既往研究證實TMB高與免疫治療預后呈正相關[5、7-8]。2015年，Science發表了首個探索TMB與NSCLC免疫治療療效的研究[4]，該研究指出高TMB的NSCLC患者接受免疫治療的臨床獲益持久率(DCB)明顯高于低TMB患者，且不論PD-L1表達狀態。多項大型臨床研究，如CheckMate-026、CheckMate-22等也證實了高TMB患者在肺癌ICIs有效性增加。從機制上講，TMB-H的腫瘤突變數量增加，這些癌細胞中異常基因編碼的肽段可被細胞表面的主要組織相容物(MHC)加工和遞呈，形成腫瘤新生抗原，并被機體內的T細胞識別，從而提高ICIs的治療敏感性。研究表明，TMB在驅動基因陽性的患者顯著降低[9]，可能原因為強勢驅動基因突變抑制其他非同義突變的產生。而在靶向治療中，有研究顯示TKI耐藥后患者TMB水平明顯升高[10]，可能因為在靶向治療的選擇性壓力下出現多樣性亞克隆和耐藥通路增加相關。

Offin等[10]評價了153名轉移性非小細胞肺癌TMB水平對靶向治療的預測價值，發現中、低TMB組的治療終止時間(TTD)和總生存(OS)顯著長于高TMB組，且低TMB組更多繼發T790M突變，首次證實TMB與NSCLC患者接受EGFR-TKI治療的臨床獲益呈負相關。作為第一個報道TMB與EGFR-TKI治療預后的研究，這項研究靶向治療未納入三代TKI藥物從而未能給出TMB對三代TKI療效的預測作用，其次，研究者選擇TTD作為療效衡量指標，而未采用在評估藥物療效方面更有說服力的PFS。

臧遠勝教授團隊[11]篩選癌癥基因組圖譜中289例EGFR突變型NSCLC患者的基因突變和生存時間信息，結果顯示高TMB組OS時間短于低TMB組(24.03個月vs未達到，P=0.0020)，是EGFR突變型晚期肺腺癌的獨立不良預后因素，但是，該研究的數據源于TCGA數據庫，無法獲得具體治療方案，因此無法給出TMB對EGFR-TKI療效的預測價值。

目前尚沒有公認的區分高、低TMB的cut-off值，考慮到諸多局限性因素，如：NGS公司眾多，檢測技術各有千秋，測序平臺參數不盡相同，NGS panel、TMB計算方法也各有差異，使得各家的結果短期內難以統一化、標準化。腫瘤突變負荷應用于肺癌免疫治療的專家共識[12]推薦各研究可根據各自臨床研究數據確定cut-off值，并進行前瞻性驗證。本研究參照一系列評價TMB在免疫治療中的價值的經典文獻，采用三分位法確定TMB cut-off值。本研究結果提示，相比高TMB組，中低TMB組患者接受靶向治療后的ORR、中位PFS明顯延長，提示預后更優。與19del突變患者相比，L858R突變患者TMB更高，中位PFS更短，為9.3m(95%CI 7.665-10.935)vs 11.2m(95%CI 9.550-12.850)，這與既往報道相符[13]。同時多因素分析發現吸煙患者的PFS更短，也是影響PFS的負向獨立預后因素，可能與煙草暴露誘發基因突變增加相關。然而，本研究同樣存在一定缺陷，包括：研究類型并非是具有更高級別循證醫學證據的前瞻性研究，樣本量較少，尤其三代TKIs病例數較少，不能了解是否三代TKI的應用可以改善高TMB患者的預后，且未同時納入OS數據以分析中國人群與預后的關系等。由于NGS使我們能夠全面了解非小細胞肺癌的遺傳狀況，因此在分析TMB與EGFR-TKIs臨床益處的相關性時，可能將其他合并突變一并納入并加以分析會更加客觀。