波形蛋白的結構與功能及其在腫瘤中的研究進展

宋雙龍,王 石

(1.內蒙古醫科大學、內蒙古自治區人民醫院，內蒙古 呼和浩特010110； 2.內蒙古醫科大學、內蒙古自治區人民醫院 肝膽胰脾外科，內蒙古 呼和浩特010110)

波形蛋白是中間絲蛋白的其中一種，由于具有復雜的生物學功能和重要作用，近年來已成為世界各地研究的熱點，它在上皮-間充質轉化過程中起著重要的作用，這一過程對癌癥轉移至關重要，因此可以進行藥物靶向波形蛋白，以減少癌癥的生長和擴散，從而幫助腫瘤的治療和延長患者的生存期。本文綜述了波形蛋白的結構與功能和在腫瘤中的作用機制及其臨床研究進展。

1 波形蛋白的結構與功能

波形蛋白的名稱來源于拉丁語單詞vimentum，廣泛表達于不同生物體的細胞和組織中[1]。波形蛋白具有三級結構，波形蛋白分子的中心α螺旋部分是所有中間產物的共同結構，有四個螺旋片段1A、1B、2A和2B與七肽重復序列的L1、L1-2和L2區域相連[2]。α-螺旋桿結構域由310個氨基酸組成,其中酸性氨基酸有70種，堿性氨基酸有46種[3]。具有基本特征的桿狀頭部N端的結構域與中央的α-螺旋桿的酸性相反，因為有12個精氨酸殘基包含于其102個氨基酸長序列中。N端部分是由7個氨基酸殘基序列組成的一個線圈1基序，在其序列中，有2個疏水殘基，為第一和第四殘基。棒狀尾部C端結構域是一個具有不同周期性疏水模式的線圈2基序構成，其中的疏水核心是由3個殘基形成，分別為第一、第四以及第八殘基。波形蛋白由不同結構的結構域組成，該蛋白不同結構域可能是相互獨立進化的，可以明確地定義和不同的功能，有助于該蛋白的功能多樣性。

波形蛋白在胚胎發育的早期階段在高度可塑的前體細胞中表達，而在出生后，在多種細胞和組織中均有表達。波形蛋白α螺旋是二聚體，二聚體的反平行結合產生四聚體，四聚體是細胞骨架的長絲狀結構的單位，波形蛋白作為一種細胞骨架，與細胞的運動密切相關，在上皮-間充質轉化(EMT)的過程和轉移中具有關鍵的作用[4]。雖然波形蛋白在成年動物中的表達僅限于某些細胞類型，但在再生過程中，如上皮傷口愈合過程中，波形蛋白可以在體內重新誘導乳腺再生[5]、神經系統再生[6]以及許多細胞類型的細胞內培養，如肌衛星細胞和上皮細胞培養。波形蛋白磷酸化等翻譯后修飾(PTM)參與波形蛋白的組裝/拆卸和功能[7-9]。此外，波形蛋白網絡可以通過蛋白質水解分解，波形蛋白的裂解可以通過半胱天冬酶、鈣蛋白酶和病毒蛋白酶等酶的作用發生，表明它們對波形蛋白功能的影響。波形蛋白還作為許多其他蛋白質的支架，通過肌動蛋白絲和微管這兩個主要絲狀組分直接相互作用，參與細胞遷移、粘附和分裂的調節[10-12]。波形蛋白還參與其他一些功能，實驗模型生動地說明了這一點。在波形蛋白敲除小鼠中，由于成纖維細胞遷移的缺陷和淋巴細胞黏附失敗致創面愈合障礙[8]。對波形蛋白基因敲除小鼠的進一步詳細分析，可以發現其細胞和組織出現了脂質代謝[13]、動脈硬化[14]以及神經方面[6]等異常情況。此外，波形蛋白在各種癌中過度表達[15]，這清楚地證明了波形蛋白在癌癥中的潛在作用。

2 波形蛋白的翻譯后修飾

波形蛋白也被認為經歷了幾個翻譯后修飾[16]，可以在特定的情況下對波形蛋白的功能特性進行調節[17]。同時，不同類型之間的翻譯后修飾可以相互作用，使調節波形蛋白功能的可能性變大。研究表明，磷酸化決定波形蛋白和中間體組裝的構象。中間絲磷酸化的主要目的是促進其功能組織化、動態亞基交換和溶解度。波形蛋白分子中的主要磷酸化結構域是Sеr-4,Sеr-38,Ser-41,Sег-71-72,Sеr-418,Ser-429，Thr457[18]等。瓜氨酸化是細胞外波形蛋白的重要修飾，這種酶修飾是由肽基精氨酸脫亞胺酶催化的，它將一種特定蛋白質中的精氨酸轉化為另一種蛋白質中的瓜氨酸。瓜氨酸化將波形蛋白轉化為類風濕性關節炎的抗原以及抗腫瘤免疫的抗原[19-20]。波形蛋白瓜氨酸化也是肝纖維化和強直性脊柱炎的潛在誘因。已經證明波形蛋白在體外的溶解度可以被SUMO化調節[16]，波形蛋白的SUMO化對其分解具有重要意義，在細胞中表達的非SUMO化波形蛋白突變體的遷移水平降低[21]。細菌SpyA對波形蛋白的ADP核糖基化在體外被鑒定，并且頭部結構域Arg殘基的ADP核糖基化可抑制波形蛋白的形成[22]。波形蛋白頭部結構域的糖基化是波形蛋白板組裝、細胞遷移和細胞內病原體復制所必需的[23]。波形蛋白糖基化導致其嚴格重新分布到核周侵襲體。通過糖基化和氧化加合物丙二醛修飾的波形蛋白可在衰老或復制性衰老的成纖維細胞中發現[24]。與中間體家族的其他成員一樣，波形蛋白可以泛素化，但中間產物蛋白質泛素化的位點還不完全清楚。

3 波形蛋白表達的表觀遺傳調控

波形蛋白表達的調節可能很復雜。最常見的表觀遺傳分子機制有四種[25]。DNA甲基化主要參與癌細胞的基因調控和沉默。Cong等人已經證明，在胃癌中，波形蛋白啟動子的甲基化水平與VIM水平呈負相關。此外，用DNA甲基化抑制劑處理包含波形蛋白基因高甲基化水平的細胞，可顯著恢復波形蛋白的表達[26]。波形蛋白在EMT中的表達高度受其啟動子區域甲基化的影響，與胃癌中波形蛋白的表達和疾病進展相反[27]。組蛋白甲基化或染色質修飾在許多表觀遺傳學現象中起著關鍵作用。Liu等人描述了一種核組蛋白去甲基化酶和胺氧化酶家族成員——賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1)，它可以募集到波形蛋白啟動子以及對人乳頭瘤病毒16 E7誘導的EMT產生催化組蛋白去甲基化的作用[28]。Gupta等人還表明，高糖條件下的組蛋白H3磷酸化與波形蛋白基因的低甲基化及其在乳腺癌細胞中的上調有關[29]。MicroRNAs(miRNAs)是一種單鏈的非編碼的調節RNA，有調節許多生物過程的能力，是參與不同疾病的表觀遺傳調節劑，已有文獻證明，波形蛋白的表達受幾種miR的調節，如miR-146b、miR-146a、miR-143、miR-210-3p、miR-1275[30-34]等。例如，miR-210-3p通過靶向TNFa誘導的蛋白3相互作用蛋白1(TNIP1)以及細胞因子信號蛋白1(SOCS1)的抑制劑促進NF-kB信號的持續激活，兩者都是NF-kB信號的兩個負調節因子，導致前列腺癌細胞系的EMT和遷移[33]。此外，一個單一的miRNA可以靶向多個基因的mRNA，無論是來自同一個基因通路或跨不同的通路，導致表達模式的全局變化。大量的miRNA似乎以協同的方式發揮作用，導致zeb/Snails/Twist和EMT效應物的蛋白表達顯著擴增來影響EMT的過程[35]。長非編碼RNA(lncRNAs)可以作為多種生物過程中的關鍵順式或反式調節因子，并且lncRNAs的突變與癌癥的發展有關[36]。波形蛋白的表達可以直接或間接地受到非編碼RNA(lncRNA)的調控，通過實驗證實，在肝細胞癌中，lncRNA可以與波形蛋白結合，從而逆轉腫瘤的惡性表型[37]。另一方面，在胃癌細胞中，lncRNA LINC00675可以增強VIM在Ser83上的磷酸化水平，導致VIM的崩解，并隨后減少細胞轉移[38]。

4 波形蛋白與上皮-間充質轉化(EMT)

EMT是在上皮細胞特定的生理過程和條件下失去上皮標記物、細胞極性、細胞間的間葉連接和細胞骨架結構的重組,轉化為具有遷移和侵襲的能力的骨髓間充質表型。EMT廣泛存在于神經系統發育、傷口愈合、纖維化和腫瘤轉移的過程中[39]。大量研究表明，波形蛋白是EMT的重要標志物，EMT在腫瘤發生發展中具有重要的意義，EMT現象是一個由誘導器、核心調節器和效應器組成的各種復雜網絡之間及時相互作用的復雜過程[40]。EMT誘導物包括轉化生長因子β(TGF-β)、BMP、受體酪氨酸激酶(RTK)、Wnt/β-catenin、NOTCH、轉錄激活因子3(STAT3)等[41-43]。這些EMT誘導因子導致EMT核心調控因子的表達和功能激活，其中包括三大類[44]。VIM調節基因轉錄因子的作用得到了一些結果的證實。據報道[4、45]，VIM通過一個反饋回路調節Snail和Slug的表達，而VIM的下調會持續重復，減少它們的mRNA，并影響它們的蛋白表達,它也作為Snail或slug誘導的EMT的下游效應，以增強細胞遷移。c-Myc也可以調節波形蛋白的表達以及EMT誘導和細胞遷移的相關通路[46]，c-Myc可以通過HDAC-6依賴的α-微管蛋白去乙酰化和波形蛋白網絡的重組，誘導細胞僵硬，并賦予癌細胞侵襲潛能，因為波形蛋白可增加細胞在貼壁培養中的侵襲潛能[47]。缺氧誘導因子-1(HIF-1)負責與缺氧相關的細胞反應、腫瘤微環境調節和EMT誘導；它還在轉錄水平上調節VIM，并在腫瘤侵襲過程中調節細胞遷移[48]。

5 波形蛋白與腫瘤

血管生成可以為腫瘤生長提供足夠的血氧，并推動腫瘤進展。越來越多的研究已經證明波形蛋白有助于血管生成。最近的一項研究證明了波形蛋白在誘導血管生成擬態中的作用，并且發現了腫瘤分級和波形蛋白表達之間的統計差異[49]。Dave等[50]回顧了波形蛋白在血管生成中的作用。在內皮細胞中，由各種細胞外促血管生成信號激活，如鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、鈣蛋白酶等將波形蛋白切割成碎片。之后，波形蛋白片段與膜基-1基質金屬蛋白酶(MT1-MMP)結合。然后，1-磷酸鞘氨醇(S1P)在Y573磷酸化MT1-MMP，然后復合物最終轉移到膜上，導致細胞外基質(ECM)降解和內皮芽形成。Notch信號轉導途徑是血管生成的關鍵介質，波形蛋白通過調節Notch信號的特定配體Dll4來影響血管生成。HO-1(血紅素加氧酶-1)通過靶向下游的VEGF調節血管生成[51]。此外，沉默VIM會導致HO-1引起的細胞增殖減少。相反，HO-1缺失后會抑制VEGF誘導的鈣蛋白酶活性和波形蛋白裂解。PARP抑制劑是腫瘤血管生成的調節因子；抑制PARP-1導致波形蛋白表達下調，并抑制血管內皮細胞中的腫瘤血管生成[52]。此外，波形蛋白還參與維持血管完整性[53]。

腫瘤的進展通常伴隨著腫瘤細胞的轉移，包括腫瘤細胞的遷移、侵襲和粘附。波形蛋白根據自身的結構和信號特征調節細胞遷移。最初的觀察發現，波形蛋白基因的表達主要在增殖細胞和未分化細胞中，隨后的研究表明，波形蛋白與癌細胞的惡性轉化和轉移擴散有關。有報道稱[3]乳腺癌與VIM過表達相關，會促進乳腺上皮細胞的侵襲和遷移，已被證明是由H-Ras-V12G和Slug誘導的。在肺癌的體外實驗中[54]，波形蛋白的下調降低了VAV2(鳥嘌呤核苷酸交換因子vav亞家族成員)的靶點Rac1的活性，從而影響細胞粘附。而且，過表達Rac1可以逆轉這一過程。這些結果為波形蛋白通過激活VAV2介導的Rac1促進黏著斑激酶穩定性的觀點提供了有力的證據。在肺腺癌早期的腫瘤微環境中，波形蛋白可能有一個關鍵的促瘤能力[55]。在前列腺上皮細胞的體內分析中，波形蛋白被證明是維持前列腺腺泡內環境穩定的關鍵。這表明波形蛋白在前列腺癌中的表達導致了高的致瘤活性。有實驗證實在肝門部膽管癌中，VIM的高表達與患者年齡、腫瘤分期等許多因素都相關[56]。也有研究發現[57]VIM可以增強肝癌細胞的遷移侵襲能力，使癌細胞更容易發生轉移。此外，波形蛋白介導的細胞遷移可被H-Ras抑制，其機制可能是H-Ras誘導波形蛋白在細胞核周圍聚集，而不是局部粘附[58]。之前的研究結果表明，當使用小干擾RNA干擾波形蛋白表達時，結腸癌細胞和乳腺癌細胞的遷移能力減弱，且乳腺癌細胞的粘附力也降低[59]。許多數據證實波形蛋白參與腫瘤細胞的侵襲，波形蛋白還與許多腫瘤的發生發展有密切的關系[60]。在體外，波形蛋白被證明是腫瘤相關成纖維細胞在集體侵襲期間運動所必需的，而波形蛋白的敲除抑制了腫瘤細胞的侵襲[61]，而且可以恢復部分其上皮表型。以上結果表明，波形蛋白參與腫瘤細胞轉移，促進腫瘤發展。

多種證據表明，波形蛋白還可以作為潛在的腫瘤標志物去預測腫瘤的發生發展。有研究顯示[62]，在對一些非小細胞肺癌患者的隨訪中，約65%患者隨訪結果證實癌細胞的轉移與波形蛋白表達高度相關。也有研究[3]已經確定在惡性黑色素瘤中，瘤細胞發生侵襲和轉移離不開波形蛋白，因此波形蛋白可以作為該疾病的臨床預測因子去預測患者的腫瘤轉移情況，從而提供個體化的治療選擇。由于VIM與轉移形成密切相關，在胃癌中VIM也是呈現高表達狀態，因此VIM可作為胃癌患者預后的一個指標，也有可能作為生物標志物去定義癌癥的侵襲性，因為胃癌的侵襲性表型也有可能是VIM導致的。骨橋蛋白通過與波形蛋白相互作用，誘導EMT并縮短肝細胞癌患者的總生存時間。此外，還發現敲除波形蛋白中的一部分殘基可以消除骨橋蛋白對肝細胞癌的作用[63]。外周血循環的循環腫瘤細胞(CTCs)在早期癌癥預防和預后監測方面取得了很大進展。但是CTC在臨床應用中的敏感性和特異性低。然而通過測量CTC表面的波形蛋白，可以使CTC的檢測變得更加準確[64]。

由于波形蛋白在各種類型的腫瘤中起著重要的調節作用，導致VIM成為一個非常有研究價值的癌癥治療的藥物靶點。研究最徹底的靶向波形蛋白的藥物可能是Withaferin A(WFA)，WFA可抑制腫瘤生長，并具有促凋亡活性。研究發現[4]，它能靶向并直接結合波形蛋白，并試圖尋找與其抗血管生成特性相關的作用模式，WFA下調波形蛋白的表達，誘導波形蛋白絲的分解。在500nM或更低的劑量下，WFA似乎沒有促凋亡，也沒有細胞毒性的作用，也不改變波形蛋白的表達水平和導致波形蛋白Ser56磷酸化。在更高劑量下，WFA改變了處理細胞的基因表達譜，這表明EMT的逆轉。在異種移植小鼠模型中，當給予WFA時，波形蛋白表達水平的變化較低，但仍可檢測到。芳基喹啉1(Arylquin 1)是3-芳基喹啉的衍生物，已被證明能與波形蛋白特異性結合，通過分泌依賴的機制導致腫瘤細胞凋亡[3]。水飛薊賓和鹽堿霉素都可以抑制波形蛋白的表達；另外水飛薊賓還可以逆轉EMT的進程以及抑制腫瘤-間質通訊的化合物，也可以抑制癌癥的發生發展。此外，還有DNA適配體NAS-24可能通過與波形蛋白結合來促進腺癌細胞的凋亡[65]。波形蛋白結合化合物FiVe1(用于foxc2抑制波形蛋白效應物1)已被證明可以選擇性地抑制間充質轉化的乳腺癌細胞的生長[66]。Plk1抑制劑伏拉塞替(volasertib)是一種誘導細胞凋亡和抑制遷移的藥物，Plk1抑制可以導致波形蛋白Ser82磷酸化水平降低[67]。薯蕷皂苷和白藜蘆醇均能抑制波形蛋白的表達，減少遷移和侵襲，熊果酸也具有這些作用，能減少腫瘤細胞的生長，誘導細胞凋亡。大蒜成分阿藿烯可以直接與波形蛋白結合并凝結成絲網，以依賴波形蛋白的方式抑制遷移和入侵[68]。波形蛋白可以通過引導治療藥物直接到腫瘤部位，在這種治療中發揮進一步的作用。白細胞介素-12可以用于癌癥的治療，但它具有毒副作用，而多肽VNTANST可以通過與癌細胞中的波形蛋白特異性結合導致腫瘤微環境中的白細胞介素-12增加，這種特異性結合可以不但可以減少白細胞介素-12的毒副作用，還可以增加它的抗癌作用[69]。他汀類藥物主要應用與降低患者的膽固醇，然而這類藥物也可以作為有效的抗癌藥物去靶向針對波形蛋白中間絲。辛伐他汀可以在不影響VIM表達缺乏的細胞的情況下，卻可以促進VIM表達的細胞死亡[70]。氟伐他汀也被證明可以誘導波形蛋白的蛋白水解，并促進癌細胞系中的細胞死亡[71]。綜上所述，靶向波形蛋白作為癌癥的一種治療方法是非常有研究價值的。

6 結論

近年來，越來越多的證據表明波形蛋白在腫瘤的發生和發展過程中發揮了關鍵的作用。波形蛋白是一種具有多種結合伙伴的功能蛋白，其中許多功能仍有待闡明。由于波形蛋白的多種作用，因此應考慮在動物移植瘤模型中進行研究對其抑制的后果。大量的波形蛋白突變已被發現在人類癌癥中；然而，它們在EMT或癌癥進展中的作用仍有待發現。調節這些機制的分子相互作用在很大程度上是未知的。因此需要開發新的策略來靶向這一關鍵蛋白的癌癥治療。