定志小丸有效成分對阿爾茲海默病轉基因模型小鼠的氧化應激、炎癥和自噬因子的作用研究

鐘曉琴，寧振求,2，王 凱,2，鄧敏貞,2*

（1.廣州中醫藥大學，廣州 510006；2.廣東省中醫院/廣州中醫藥大學第二附屬醫院/廣東省中醫藥科學院，廣州 510120）

阿爾茲海默病是一種常見的神經退行性疾病，其臨床表現是學習障礙、記憶力下降等認知能力損傷[1]。研究報道淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）水解后會誘發β 淀粉樣蛋白（Aβ）增加，其異常沉積會引起神經元損傷和神經炎癥等病理現象[2]。此外，神經炎癥的加劇也會誘發氧化應激的發生發展[3]。在阿爾茲海默病的神經元中Aβ 會損害自噬小泡的運輸過程，造成阿爾茲海默病相關的自噬病理現象[4]。定志小丸是治療神經系統疾病的經典方劑，本課題組前期研究發現其成分對血管性癡呆小鼠具有緩解海馬神經元損傷的作用[5]。因此，本實驗研究定志小丸成分對阿爾茲海默病模型小鼠的作用及其機制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料 70 只APP/PS1 雄性小鼠（SPF 級，5月齡）和10 只C57BL/6 雄性小鼠（SPF 級，5 月齡）購于廣州中醫藥大學實驗動物中心，動物使用許可證號是SYXK（粵）2018-0034。本實驗經過廣東省中醫院動物倫理委員會審核通過，其倫理編號是2020001。實驗動物在日照時長12 h，自由飲水，溫度（22±2）℃，濕度（55±5）%的SPF 級環境中適應飼養3 d 后再進行實驗。人參皂苷Rb3 和β-細辛醚（批號：wkq18020701 和wkq18042602，純度≥98%，四川省維克奇生物技術有限公司）；多奈哌齊片（批號：1806077，每片10 mg，中國衛材藥業有限公司）；Akt 抑制劑（LY294002，貨號：S1105，美國Selleck 公司）；自噬抑制劑（3-methyladenine，貨號：S2767，美國selleck 公司）；單胺氧化酶（MAO）、活性氧（ROS）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHDG）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）和Beclin-1 ELISA 試劑盒（批號均是01/2021，上海酶聯生物科技有限公司）；蘇木素伊紅染色試劑盒（貨號：C0105M，上海碧云天生物技術有限公司）。多功能染色機（ST5020，上海徠卡儀器有限公司）；基礎型分散機（IKA T10，德國IKA 公司）；高速冷凍離心機（5804R，德國Eppendorf 公司）；電子天平（ME403，上海梅特勒-托利多國際貿易有限公司]；全波長酶標儀（Biotek-EON，美國伯騰儀器有限公司）。

1.2 實驗分組與給藥劑量 將轉基因小鼠隨機分為6組：模型組、人參皂苷Rb3 組（15 mg/kg，灌胃），β-細辛醚組（45 mg/kg，灌胃），聯合組（人參皂苷Rb3 15 mg/kg 加β-細辛醚45 mg/kg，灌胃），多奈哌齊組（3 mg/kg，灌胃）、Akt 抑制劑組（25mg/kg，腹腔注射給藥）和自噬抑制劑組（30 mg/kg，灌胃），并設正常組（C57BL/6 小鼠），每組10 只。除模型組和正常組給予等體積生理鹽水，各組給藥30 d，每天1 次。

1.3 檢測指標

1.3.1 ELISA 檢測小鼠皮質組織MAO、ROS、8-OHDG、TNF-α、IL-6、IL-10 和Beclin-1 的含量 各組小鼠給藥結束后，經10%水合氯醛（350 mg/kg，灌胃）麻醉，用生理鹽水心臟灌注后，迅速在冰臺上開顱取腦，分離皮質組織，保存在-80 ℃冰箱待用。把組織按1:9（重量g : 體積mL）比例加入生理鹽水，電動勻漿后4 ℃ 10 000 r/min 離心10 min，取組織上清液，按試劑盒說明書操作，用酶標儀檢測對應指標的吸光度。

1.3.2 HE 染色觀察小鼠皮質組織形態 把各組小鼠皮質組織用4%水合氯醛固定24 h，按常規脫水包埋操作，按4 μm 厚度切片，把各組玻片置自動染色機進行HE 染色處理，中性樹脂封片，置光學顯微鏡中觀察組織病理狀態。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0 統計軟件，所有數據用均數±標準差（）表示，兩兩比較采用單因素方差分析檢驗。

2 實驗結果

2.1 各組小鼠氧化應激相關因子MAO、ROS 和8-OHDG 的含量變化 從圖1 可知，與正常組比較，模型組的MAO、ROS 和8-OHDG 含 量增加（P＜0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細辛醚組、聯合組、多奈哌齊組和自噬抑制劑組的MAO、ROS、8-OHDG 含量減少（P＜0.01），而Akt 抑制劑組的MAO、ROS 和8-OHDG 含量增加（P＜0.01）。與多奈哌齊組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細辛醚組、聯合組和Akt 抑制劑組的MAO、ROS、8-OHDG 含量增加（P＜0.01），而自噬抑制劑組的MAO、ROS、8-OHDG 含量減少（P＜0.01）。與自噬抑制劑組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細辛醚組、聯合組和Akt 抑制劑組的MAO、ROS、8-OHDG 含量增加（P＜0.01）。

圖1 各組小鼠皮質中MAO、ROS 和8-OHDG 的含量變化

2.2 各組小鼠炎癥相關因子TNF-α、IL-6 和IL-10 的含量變化 從圖2 可知，與正常組比較，模型組的TNF-α 和IL-6含量增加（P＜0.01），IL-10含量減少（P＜0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細辛醚組、聯合組、多奈哌齊組和自噬抑制劑組的TNF-α 和IL-6 含量減少（P＜0.01），IL-10 含量增加（P＜0.01），而Akt 抑制劑組的TNF-α 和IL-6 含量增加（P＜0.01），IL-10 含量減少（P＜0.01）。與多奈哌齊組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細辛醚組、聯合組和Akt 抑制劑組的TNF-α 和IL-6 含量增加（P＜0.01），IL-10 含量減少（P＜0.01），而自噬抑制劑組的TNF-α 和IL-6 含量減少（P＜0.01），IL-10 的含量增加（P＜0.01）。與自噬抑制劑組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細辛醚組、聯合組和Akt 抑制劑組的TNF-α 和IL-6 的含量增加（P＜0.01），IL-10 含量減少（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠皮質中TNF-α、IL-6 和IL-10 的含量變化

2.3 各組小鼠的自噬相關因子Beclin-1 的含量變化 從圖3 可知，與正常組比較，模型組的Beclin-1含量增加（P＜0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3組、β-細辛醚組、聯合組、多奈哌齊組和自噬抑制劑組的Beclin-1 的含量減少（P＜0.01），而Akt 抑制劑組的Beclin-1 的含量增加（P＜0.01）。與多奈哌齊組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細辛醚組、聯合組和Akt 抑制劑組的Beclin-1 含量增加（P＜0.01），而自噬抑制劑組的Beclin-1 含量減少（P＜0.01）。與自噬抑制劑組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細辛醚組、聯合組和Akt 抑制劑組的Beclin-1 含量增加（P＜0.01）。

圖3 各組小鼠皮質中Beclin-1 的含量變化

2.4 各組小鼠的皮質組織病理學情況 如圖4 所示，正常組的皮質組織細胞數量較多，排列整齊，細胞致密，而模型組和Akt 抑制劑組的細胞間隙較大，細胞核數量較少、核固縮明顯，細胞排列較為稀疏和雜亂。人參皂苷Rb3 組、β-細辛醚組、聯合組、多奈哌齊組和自噬抑制劑組的細胞間隙不太明顯，細胞核固縮有所緩解。

圖4 各組小鼠皮質的組織病理學情況（×200，標尺是100 μm）

3 討論

阿爾茲海默病是多因素誘發的復雜的神經退行性疾病，氧化應激反應、神經炎癥反應、自噬障礙等是導致阿爾茲海默病產生與發展的重要因素[6]。研究發現自噬障礙會造成Aβ 的異常堆積，Aβ 還可通過產生活性氧和激活小膠質細胞，加重氧化應激反應和炎癥反應，加劇神經元功能紊亂，導致神經元的發生病理損傷[7]。由于阿爾茲海默病病機多樣性且尚不明確，傳統用來治療阿爾茲海默病的藥物（多奈哌齊、美金剛等）雖可以減緩阿爾茲海默病病程,以對癥治療為原則，長期服用會有明顯毒副作用[8-9]。中藥具有多靶點且不良反應小的優勢[10]，而阿爾茲海默病的臨床表現屬于中醫“呆癥”的范疇，可選用源于《備急千金要方》的益智方劑定志小丸，其具有化痰開竅、益智定志之功效[11]。本課題組前期研究發現定志小丸中人參皂苷Rb3 聯合β-細辛醚對血管性癡呆模型小鼠具有緩解神經元損傷的作用[5]，但其機制尚不明確。因此，本實驗主要研究定志小丸成分對阿爾茲海默病模型小鼠的作用及其作用機制。

抗氧化能力不能完全清除體內氧自由基就會激活氧化應激反應，ROS 可以攻擊生物膜使膜脂過氧化，過氧化產物會損傷生物膜的結構和功能，嚴重者可以導致細胞的死亡[12]。8-OHDG 是DNA 中鳥嘌呤堿基第8 位碳原子被活性氧自由基攻擊而產生的一種氧化性加合物[13]。MAO 是存在于神經元、膠質細胞等機體細胞中的一類催化酶，既能夠催化單胺類遞質的代謝，使單胺類神經遞質減少，也能增加氧自由基的生成，加劇神經功能損害[14]。本實驗結果表示，阿爾茲海默病模型小鼠的ROS、8-OHDG 和MAO 的含量比正常組小鼠都增加，符合阿爾茲海默病病理表現。經過人參皂苷Rb3 組、β-細辛醚組、聯合組和自噬抑制劑組的干預后，其氧化應激相關因子都有所減少，提示定志小丸成分對阿爾茲海默病模型小鼠的氧化應激具有一定的抑制作用。

阿爾茲海默病發生神經炎癥的關鍵證據是阿爾茲海默病大腦中促炎細胞因子負荷增加[15]。腦組織炎癥反應，釋放TNF-α 等炎性因子損傷大腦神經元，導致認知功能下降[16]。IL-6 屬于促炎因子，IL-10 屬于內源性的抗炎介質[17]。通過本實驗結果可知，與正常組比較，模型組的TNF-α 和IL-6 含量增加，IL-10 含量減少，提示阿爾茲海默病小鼠發生炎癥反應。給予人參皂苷Rb3、β-細辛醚和自噬抑制劑的阿爾茲海默病模型小鼠，TNF-α 和IL-6 含量減少，IL-10 含量增加，這說明各給藥組都具有一定抗炎作用。

Beclin-1 是啟動自噬小體的關鍵因子[18]。研究發現自噬泡中富含淀粉樣前體蛋白、Aβ 及γ-分泌酶，誘導自噬可引起 Aβ 增多[19]。本實驗結果發現，阿爾茲海默病模型小鼠的Beclin-1 表達較高，提示阿爾茲海默病小鼠處于自噬激活狀態，經過人參皂苷Rb3 組、β-細辛醚組、聯合組和自噬抑制劑組干預的模型小鼠，它們的Beclin-1 表達都顯著減少，這說明定志小丸成分對阿爾茲海默病模型小鼠具有一定抑制自噬的作用。PI3K/Akt/mTOR 信號通路參與了細胞生理過程（如生長、增殖等）的調控[20]。在本實驗結果也發現，自噬抑制劑組的抗氧化和抗炎也較為顯著，而Akt 抑制劑組的促炎和激活氧化反應尤為突出，這提示定志小丸成分可能具有激活Akt 來減緩神經元損傷和自噬的作用。

綜上所述，定志小丸有效成分對阿爾茲海默病模型小鼠具有保護神經元的作用，表現為抗氧化應激和抑制神經炎癥，其機制可能是通過激活Akt 通路來降低細胞自噬的激活程度。