循經通絡推拿結合藥物對乳腺增生大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的影響

紀 寧，李 麗，阮 迪，李丹丹

（新疆維吾爾自治區中醫醫院推拿科，烏魯木齊 830099）

乳腺增生癥（mammary gland hyperplasia，MGH）是中青年女性最為常見的一種乳腺疾病，主要以乳房非炎性腫塊及周期性脹痛為臨床特征[1]，中醫有“乳癖”之稱。乳腺增生癥的發病機制目前已公認與內分泌激素失調所致的雌激素分泌絕對升高，孕激素分泌絕對或相對不足相關，下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸是調控乳腺生理和病理變化的關鍵途徑，其功能的紊亂與乳腺增生癥發生發展關系密切[2]。推拿治療具有無不良反應、遠期療效好、患者易于接受的優勢，在大量臨床研究中已驗證其作用于乳腺增生癥的有效性。本實驗采用孕雌激素聯合造模法復制乳腺增生癥大鼠模型，觀察循經通絡推拿手法及抗雌激素藥物三苯氧胺單純或聯合應用對乳腺增生癥大鼠的治療作用，并探討其通過調控下丘腦-垂體-卵巢軸治療乳腺增生癥的相關機制。

1 實驗材料

SD 雌性大鼠50 只，SPF 級，體質量（180±220）g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供，于溫度（23±3）℃、相對濕度 40%～70% 的環境下適應性飼養1 周。苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液（北京索萊寶有限責任公司），三苯氧胺（上海華聯制藥有限公司），蘇木素染液（福州邁新生物技術開發有限公司），伊紅染液（北京中杉金橋生物技術有限公司），大鼠卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒均（武漢華美生物工程有限公司），促性腺激素釋放激素（GnRH）、垂體促性腺激素釋放激素受體（GnRH-R）一抗（北京博奧森生物技術有限公司），Real-time PCR 試劑盒（TaKaRa 公司）。高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技公司），酶標儀、電轉儀（美國Bio-Rad 公司），電泳儀（北京六一生物技術有限公司），光學倒置顯微鏡（日本尼康），凝膠成像系統（上海天能科技有限公司），RT-RCR 儀（美國 ABI 公司）。

2 實驗方法

2.1 造模方法 大鼠按體質量隨機分為5 組（對照組、模型組、手法組、藥物組、藥物加手法組），每組10只。除對照組外，其余各組均采用肌肉注射雌二醇和黃體酮法制備乳腺增生癥模型[3]：肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液（0.5 mL/kg），每日1 次，持續25 d，繼而改用黃體酮注射液（5 mg/kg）肌肉注射，每日1 次，持續5 d。造模結束后，觀察各組大鼠乳頭外觀形態，測量乳頭直徑與高度，并取第2對乳房組織作標本切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色觀察病理形態改變。以大鼠乳頭紅腫豎起高于皮膚表面，乳頭直徑、高度增加，HE染色見乳腺小葉增多、導管及腺泡腔擴張等為造模成功。

2.2 治療方法 手法組于造模同時給予循經通絡推拿手法：1）指腹直推大鼠前肢內側至腋窩處（手三陰經），并延乳房外圍向乳頭方向指揉乳絡；2）指腹直推大鼠后肢內側根部至后掌足跖（足三陰經）；3）指腹直推大鼠頸部至恥骨（任脈）、頸部至尾根部（督脈）；4）指揉大鼠乳房部；直推、按揉力度、速度適中、順逆經交替，每次治療10 min，至局部皮膚發紅。藥物組給予三苯氧胺（0.5 mg/kg）灌胃，藥物加手法組同時給予三苯氧胺（0.5 mg/kg）及循經通絡推拿手法治療，每日 1 次，連續30 d。對照組與模型組不予干預。

3 檢測指標

3.1 大鼠乳頭直徑與高度測量 治療結束后，各組大鼠第2 對左右乳頭用精密游標卡尺測量直徑與高度，比較模型組與對照組，治療組與模型組以及各治療組之間的差異。

3.2 HE 染色觀察乳腺組織病理形態變化 大鼠腹主動脈取血后處死，解剖后取第2 對右側乳房，取部分乳腺組織于4 %多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片機作 5 μm 切片后行蘇木素-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡于不同倍數下觀察乳腺組織形態學改變并拍照。

3.3 ELISA 實驗檢測血清FSH、LH 含量變化 大鼠麻醉后腹主動脈取血，3 000 r/min 離心10 min 取血清，按ELISA 試劑盒說明書要求操作：樣品孔加入樣品稀釋劑40 μL、檢測抗體100 μL 及血清樣品10 μL，置于37 ℃恒溫箱重孵育1 h，洗滌劑洗板5 次，加入顯色液A、B 各50 μL，于37 ℃恒溫箱中避光孵育15 min，隨后加入終止液50 μL，于酶標儀450 nm 下檢測各反應孔OD 值，建立標準曲線，代入各樣本OD 值計算FSH、LH 的含量。

3.4 Western-blot 檢測下丘腦GnRH 與垂體GnRH-R 蛋白表達 取各組大鼠下丘腦和垂體組織，剪碎后置于裂解液中，勻漿器于冰上勻漿，12 000 r/min 離心 20 min提取總蛋白，BCA 法檢測組織蛋白濃度。經制膠、上樣、電泳、轉膜及封閉后，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃下孵育2 h，ECL 發光液孵育，凝膠成像系統曝光，以β-actin 為內參測定各組灰度值，分析相對蛋白含量。

3.5 RT-PCR 檢測下丘腦GnRH與垂體GnRH-R mRNA 表達 取大鼠部分下丘腦及腦垂體組織，Trizol法提取組織總RNA，測定總RNA 濃度，分別進行逆轉錄、cDNA 擴增，引物序列為：GnRH 上游引物5’-CCGCTGTTGTTCTGTTGACT-3’，下游引物5’-GCAGATCCCT AAGAGGTGAA-3’；GnRH-R上游引物 5’-TCACTCAGCCCTTAGCTGTCC-3’，下游引物 5’-GAAGGCTTCATGCCACCATTG-3’。反應條件為：95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行 40個循環。以2-△△Ct法分析mRNA相對表達量。

3.6 統計學處理 采用 SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，數據均以均值±標準差（）表示，兩組以上數據采用單因素方差分析比較。

4 結果

4.1 大鼠乳頭直徑與高度比較 與對照組比較，模型組兩側乳頭高度、直徑增大明顯（P＜0.05）；各治療組乳頭高度和直徑較模型組顯著減小（P＜0.05）；其中藥物組乳頭直徑、藥物加手法組乳頭高度和直徑較手法組減小更為明顯（P＜0.05）；藥物加手法組大鼠左側乳頭直徑較藥物組減小更為明顯（P＜0.05），見表 1。

表1 各組大鼠乳頭直徑及高度比較（，n =10） mm

表1 各組大鼠乳頭直徑及高度比較（，n =10） mm

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與手法組比較，▲P ＜0.05；與藥物組比較，□P ＜0.05

4.2 大鼠乳腺組織病理形態學觀察 對照組乳腺小葉形態規則，未見明顯增生，腺泡較少，腺泡腔及導管管腔未見擴張，個別導管內可見少量分泌物；模型組可見乳腺小葉增生，腺泡增大，導管管腔擴張，導管上皮細胞增生，導管內含較多分泌物；與模型組相比，手法組和藥物組大鼠乳腺組織病變改善不明顯，藥物加手法組乳腺小葉增生減少，乳腺導管擴張減輕，導管內分泌物減少，見圖 1。

圖1 各組大鼠乳腺組織病理學變化（HE 染色）

4.3 大鼠血清FSH、LH 水平比較 藥物組和藥物加手法組FSH 水平較模型組明顯降低，LH 水平明顯升高（P＜0.05），其中藥物加手法組與手法組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。

表2 各組大鼠血清FSH、LH 水平（，n =10）

表2 各組大鼠血清FSH、LH 水平（，n =10）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與手法組比較，▲P ＜0.05

4.4 大鼠下丘腦GnRH 與垂體GnRH-R 的蛋白表達 藥物加手法組GnRH、GnRH-R 的表達較模型組均明顯減少（P＜0.05），其中藥物加手法組與手法組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠下丘腦GnRH 與垂體組織GnRH-R 的蛋白表達（，n =6）

表3 各組大鼠下丘腦GnRH 與垂體組織GnRH-R 的蛋白表達（，n =6）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與手法組比較，▲P ＜0.05

4.5 大鼠下丘腦GnRH 與垂體GnRH-R 的mRNA表達 藥物組、藥物加手法組較模型組明顯減少了GnRH、GnRH-R 的mRNA 表 達（P＜0.05），其 中藥物加手法組與手法組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 4。

表4 各組大鼠下丘腦GnRH 與垂體組織GnRH-R 的mRNA 表達（，n =6）

表4 各組大鼠下丘腦GnRH 與垂體組織GnRH-R 的mRNA 表達（，n =6）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與手法組比較，▲P ＜0.05

5 討論

近年來，乳腺增生癥發病率逐年上升，發病趨勢呈現低齡化，且伴有一定的癌變風險，受到中青年女性的極大關注[4]。西醫針對此病常采用抗雌激素類藥物治療，但存在副作用多、不適合長期應用、停藥后易復發等缺點[5]。推拿作為中醫特色療法，通過推揉按摩經穴而激發經絡氣機，達到疏通經絡，行氣運血的作用，以其遠期療效好、無不良反應等優勢得到了患者的廣泛認可[6]。

乳腺增生癥屬于中醫學“乳癖”范疇，病屬本虛標實，以腎氣不足，沖任失調為本，肝脾郁結，氣滯、痰凝、血瘀凝滯為標，故治療當以調節沖任，疏肝健脾為主，配以化痰散結，暢通經絡之法[7-9]。乳房為“宗經之所”，多條經脈在此匯聚[10]，足厥陰肝經布于兩脅，環繞乳頭而行；足太陰脾經絡胃，上膈，散布胸脅，行至乳頭之外；足少陰腎經貫肝膈，其支脈入胸中，故循經推拿以足三陰經為主。沖任二脈同起于胞中，沖脈與足少陰經并行向上而布于胸中，任脈行于兩乳之間，乳房的生理病理狀態直接受此二脈經氣盈虧的調節[11]；督脈行于背脊正中，為“陽脈之海”，任脈為“陰脈之海”，二脈通調則百脈皆通[12]。此外，手三陰經分布于上肢及腋窩，過胸部乳頭外側，肝有邪常客于兩腋，手法作用于此三脈亦可達到疏肝散結之效。

本研究采用循經通絡推拿手法作用于大鼠足三陰、手三陰經、任脈、督脈和乳房部，在此基礎上結合西藥三苯氧胺，觀察西藥和手法單獨或聯合應用對乳腺增生大鼠的治療效果。

結果顯示，與模型組比較，各治療組大鼠第2 對乳頭直徑與高度均顯著減小，其中手法加藥物組效果最明顯。HE 染色可見，模型組乳腺組織增生病變明顯，提示造模成功，藥物加手法組明顯減輕了乳腺組織的病變程度，而藥物組和手法組對病變改善均不明顯，提示推拿聯合藥物的治療效果優于單純應用手法和藥物。

乳腺增生癥的發生與下丘腦-垂體-卵巢軸的功能紊亂密切相關[13]。下丘腦所分泌的 GnRH 是下丘腦-垂體-卵巢軸中最為關鍵的神經介質，其與垂體促性腺細胞上具有高親和力的受體GnRH-R 結合后，能夠刺激垂體合成和釋放FSH 和LH，二者的分泌進一步作用于卵巢，刺激卵巢分泌雌激素與孕激素，從而調節乳腺組織的生理和病理改變[14]。過量分泌的FSH 可激活卵巢顆粒細胞合成和釋放雌二醇（E2），導致乳腺增生癥[15]。而LH 含量的降低可造成 P 的生成不足，E2和P 之間平衡被打破，使E2生成過多，使乳腺增生癥間接加重[16]。本實驗結果提示推拿手法聯合藥物可能通過干預下丘腦-垂體-卵巢軸的內分泌功能，使GnRH 及其受體的生成減少，從而調節FSH 和LH 的分泌水平，拮抗激素紊亂引起的乳腺增生癥。

前期研究發現，循經通絡推拿療法用于乳腺增生癥患者臨床總有效率可達100%[17]。本實驗中單純應用推拿手法顯著減輕了乳腺增生癥大鼠乳頭高度和直徑的增大，提示其對外源性雌激素所致乳腺增生癥具有明顯療效。病理學和分子檢測中雖未見明顯改善，但聯合藥物治療時卻發揮了協同作用。推拿等保守療法療程長，對癥狀的改善見效較慢；三苯氧胺等抗雌激素藥物療效明顯，但停藥后易復發。本實驗顯示循經推拿手法聯合三苯氧胺具有一定的協同增效作用，提示內服與外治并重對下丘腦-垂體-卵巢軸功能和激素水平能夠起到更好的調節作用。