中藥藥對黃連-苦參配伍的化學成分動態變化

邢冰琪，李 玥，李 娟*

（1.山東省立第三醫院藥學部，濟南 250031；2.泰安市中心醫院，山東 泰安 271000）

中藥配伍理論是中醫藥理論的精華之一，開展方劑配伍規律的現代研究對于繼承和發展中藥配伍理論具有重要理論意義,同時也為更有效地指導臨床和中藥新產品研制提供依據[1-4]。心律失常是臨床上主要心血管疾病之一，研究表明黃連、苦參均對心血管疾病療效顯著，黃連解毒湯及其配伍成分在臨床上已用于高血壓病、心絞痛的治療，苦參堿可以從多個方面作用于心血管系統，具有抗心律失常、抗慢性心功能不全、保護心肌缺血、抗心肌細胞纖維化等作用。本文旨在探討不同配伍苦參與黃連聯用的生物堿成分的變化及抗心律失常的作用，為臨床應用苦參和黃連提供更多的實驗依據。

本實驗通過考察不同比例黃連-苦參水煎液“共有峰”的影響，為研究黃連與苦參的藥效物質基礎成分變化提供可行手段。本文旨在建立黃連、苦參的HPLC 指紋圖譜測定方法。利用指紋圖譜分析軟件，分析黃連、苦參水煎液7 個不同比例配伍后樣品間的內在差異。為臨床辨證用藥，方劑審因增減提供依據，也為制定復方的質量標準提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1260 高效液相色譜儀、AE200 電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），KDM可調控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱有限公司），SK5200H超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司），AB135-S 電子分析天平，HH 恒溫水浴鍋，876-1 型真空干燥箱（南通科學儀器廠），SENCOR-205 旋轉蒸發儀（上海申順生物科技有限公司）。

1.2 試藥 鹽酸小檗堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110713-100911）、苦參堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110805-201117）、氧化苦參堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110780-201007）、藥根堿對照品（上海源葉科技有限公司，批號：20111109）、槐定堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110784-200303）、鹽酸巴馬汀對照品（北京恒元啟天化工技術研究院、北京世紀奧科生物技術有限公司聯合研制，批號：MUST-11122703）、甲醇（TEDLA，MS1922-001,LOT:13065034）、乙腈（TEDLA,AS1122-001,LOT:13075017）、磷酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：2012120）、超純水（液相用）、去離子水（提取用）、其它試劑為分析純，黃連（批號：130308）、苦參（批號：130321）藥材購自于山東中醫藥大學附屬醫院，；經山東中醫藥大學附屬醫院教授張學順鑒定，黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch 干燥根莖。苦參為豆科植物苦參Sophora flavescensAit.的干燥根。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成0.603 mg/mL 的溶液，作為對照品溶液。取苦參堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含0.553 mg 的溶液，作為對照品溶液。取氧化苦參堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含0.550 mg 的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 將不同比例配伍的樣品分別置于圓底燒瓶中，加12 倍量水回流提取，提取3 次，每次提取2 h，合并3 次提取液，濾過，濾液濃縮并定容至50 mL，作為濃儲液，取1 mL 加水定容至10 mL容量瓶，作為供試品溶液。

2.2 高效液相色譜法色譜條件的篩選

2.2.1 流動相的確定 為了考察并優化高效液相色譜條件，本實驗選取了4 組流動相系統：乙腈:純水、乙腈:0.1%磷酸水溶液、甲醇:純水、甲醇:0.1%磷酸水溶液，各流動相系統的色譜圖如下，由色譜圖結果可知：以乙腈:0.1%磷酸水溶液的流動相系統進行梯度洗脫，色譜圖的主要色譜峰保留時間適中，分離度良好，因此選擇乙腈:0.1%磷酸水溶液的流動相系統進行梯度洗脫[5-7]，見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

2.2.2 檢測波長的選擇 取同一配伍（黃連：苦參1:1）供試品溶液進行試驗，分別測定供試品溶液在210 nm、220 nm、265 nm、345 nm 下的色譜圖，每次進樣20 μL，結果表明：樣品在220 nm 檢測波長下，各色譜峰保留時間適中，分離度良好，基線平整且色譜圖包含信息量較大，故選取220 nm 為高效液指紋圖譜的檢測波長[8-10]。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一對照品溶液進行試驗，每次進樣20 μL，連續進樣6 次，測定各共有峰的相對峰面積和相對保留時間，計算得RSD 均＜3%，表明儀器精密度良好。利用SPSS 軟件進行指紋圖譜相似度分析，相似度均＞0.9。

2.3.2 穩定性試驗 取同一配伍（黃連:苦參=1:1）供試品溶液進行試驗，每次進樣20 μL，每隔2 h 分別進樣2 次，測定各共有峰的相對峰面積和相對保留時間，計算得RSD 均＜3%。表明樣品在12 h 內穩定，利用SPSS 軟件進行指紋圖譜相似度分析，相似度均＞0.9。

2.3.3 重復性試驗 取同一配伍（黃連:苦參=1:1）制備6 份供試品溶液，進樣2 次，每次進20 μL，測定各共有峰的相對峰面積和相對保留時間，計算得RSD均＜3%。表明樣品重復性符合要求，利用SPSS 軟件進行指紋圖譜相似度分析，相似度均＞0.9。

2.4 指紋圖譜測定 分別精密吸取不同配伍的黃連、苦參合煎液和分煎混合液各20 μL，注入高效液相色譜儀，按優選的指紋圖譜梯度進行洗脫，記錄90 min 的高效液相色譜圖（見圖1）和各色譜圖的峰面積、保留時間，結果見表2，表3。

圖1 不同比例配伍的供試品溶液指紋圖譜

表2 共有峰的相對峰面積

表3 共有峰的保留時間

2.4.1 共有峰面積 計算各樣品中的共有峰峰面積，求得各共有峰峰面積占總峰面積的百分比。見表4。

表4 共有峰面積的百分比

2.4.2 相似度計算 利用SPSS 軟件進行指紋圖譜相似度分析，相似度均＞0.9。見表5。

表5 相似度計算結果

2.4.3 共有峰的確定 比較不同比例配伍的黃連、苦參藥對的指紋圖譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統綜合分析最終確定以下18 個峰為指紋圖譜的共有峰（見圖2），其中峰7、8、9、10、11、12、13、14、15 來自于黃連，其余峰來自于苦參。因各比例中黃連為定量，分析各配伍比例來自黃連的共有峰的峰面積，得7、9、10、15 號共有峰的峰面積隨配伍比例的改變變化不大，14 號峰隨配伍比例的改變各共有峰峰面積有顯著性差異。將苦參取樣量轉換為3 g，分析得苦參中各共有峰峰面積受配伍比例的改變影響較大。

圖2 指紋圖譜共有峰

2.4.4 各共有峰的歸屬 將各對照品溶液按指紋圖譜梯度洗脫條件進樣，得2 號峰為槐定堿，3 號峰為苦參堿，4 號峰為氧化苦參堿，12 號峰為藥根堿，13 號峰為巴馬汀，14 號峰為鹽酸小檗堿。

3 討論

實驗建立了黃連-苦參的HPLC 指紋圖譜測定方法，利用指紋圖譜分析軟件，分析黃連-苦參水煎液7個不同比例配伍后樣品間的差異，來自黃連的7、9、10、15 號共有峰的峰面積隨配伍比例的改變變化不大，而14 號峰鹽酸小檗堿峰面積隨配伍比例改變有顯著性差異，來自苦參中的苦參堿、氧化苦參堿各共有峰峰面積受配伍比例的改變影響較大。本研究通過建立黃連-苦參藥對的HPLC 指紋圖譜，確定了15 個共有峰，并通過主要生物堿的含量測定分析出黃連-苦參的配伍變化的規律，能夠對該藥對的質量控制以及臨床使用提供參考。

綜上，本研究建立的黃連-苦參藥對的HPLC 指紋圖譜測定方法穩定可靠，確定了15 個共有峰，能夠對該藥對的質量控制以及臨床使用提供參考。