基于高通量測(cè)序診斷馬爾尼菲藍(lán)狀菌病1例報(bào)道

王增睿， 楊 霞， 寧 宗

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530000；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，廣西 南寧 530000）

馬爾尼菲藍(lán)狀菌（Talaromyces marneffei）又名馬爾尼菲青霉菌，是一種雙相性深部致病性真菌，最早在竹鼠的病變肝臟中被分離出來，多分布于東南亞、印度東北部和中國(guó)南部[1]。馬爾尼菲藍(lán)狀菌感染好發(fā)于免疫功能低下或缺陷人群，主要累及單核巨噬細(xì)胞，可侵犯人體多個(gè)系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，病死率高，早期診斷和治療是降低病死率的關(guān)鍵[2]。目前，馬爾尼菲藍(lán)狀菌的主要檢測(cè)方法為血液或組織真菌培養(yǎng)、涂片染色、病理學(xué)檢查等，由于檢出率不一、耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)等缺點(diǎn)，在一定程度上延誤了該病的診斷和治療[3]。高通量測(cè)序[又稱下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）]技術(shù)可不依賴于培養(yǎng)，直接檢測(cè)臨床樣本（血液、腦脊液、肺泡灌洗液、尿液等）中微生物的DNA或RNA，通過分析其特異性基因片段的含量與豐度，通過生物信息學(xué)分析全面鑒定細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲。相較于傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)，NGS具有通量高、鑒定譜廣、檢測(cè)時(shí)間短、敏感性好等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。目前，馬爾尼菲藍(lán)狀菌引起人類感染的報(bào)道較少，此前有個(gè)案報(bào)道采用NGS診斷馬爾尼菲藍(lán)狀菌致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[6]。現(xiàn)就廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1例基于NGS技術(shù)診斷馬爾尼菲藍(lán)狀菌感染的病例進(jìn)行報(bào)道，為此類病例的診療提供參考。

1 病例資料

患者，男，49歲，因“左下肢疼痛伴發(fā)熱3月余”，于2020年3月10日急診收入廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院?；颊哂?019年12月29日無明顯誘因出現(xiàn)左下肢疼痛，進(jìn)行性加重，多位于左側(cè)髖部、大腿內(nèi)側(cè)，伴發(fā)熱，無畏寒、寒戰(zhàn)，體溫最高38.5 ℃。2020年1月2日至外院就診，行髖關(guān)節(jié)磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）平掃：左側(cè)髖臼及坐骨異常信號(hào)，考慮骨髓水腫，左側(cè)閉孔內(nèi)外肌、上下孖肌、股內(nèi)側(cè)肌、股四方肌、恥骨肌、臀大肌腫脹，水腫。血培養(yǎng)（雙側(cè)）：沙門菌，對(duì)頭孢他啶、左氧氟沙星等敏感。雙髖關(guān)節(jié)MRI：左大腿上段-左髖關(guān)節(jié)周圍軟組織改變，考慮炎性病變并膿腫形成，擬左側(cè)股骨頸、左側(cè)髖臼骨髓水腫。胸部電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）：考慮兩肺炎癥，縱膈及右肺門多發(fā)腫大淋巴結(jié)，不排除右肺下葉病變?yōu)檎嘉豢赡埽粌蓚?cè)少量胸腔積液；擬肺氣腫（小葉中心型）改變。骨髓形態(tài)學(xué)檢查：成熟漿細(xì)胞占11%，成熟紅細(xì)胞呈緡錢狀（多發(fā)性骨髓瘤待排）。胸骨前壁腫物B超：皮下混合性回聲團(tuán)（膿腫？）。于2020年2月6日行左大腿肌層膿腫切開探查引流及任意皮瓣成形術(shù)。膿液培養(yǎng)示陰溝腸桿菌。曾予氧氟沙星+美羅培南+萬古霉素+復(fù)方磺胺甲噁唑聯(lián)合抗感染治療，治療后患者仍有反復(fù)發(fā)熱，為進(jìn)一步明確診斷至廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診。既往史：否認(rèn)高血壓、冠心病、糖尿病史，否認(rèn)肝炎、結(jié)核或其他傳染病史，否認(rèn)外傷史，有青霉素過敏史。入院查體：體溫36.5 ℃，脈搏107次/min，呼吸22次/min，血壓14.50/9.44 kPa。神志清，貧血面容，皮膚鞏膜無黃染，全身淋巴結(jié)未捫及腫大，頸靜脈正常。胸骨下段可見1塊約4 cm×3 cm的腫物（圖 1），有波動(dòng)感，無觸痛。左側(cè)大腿內(nèi)可見1條長(zhǎng)約 5 cm的陳舊性疤痕。余未見明顯異常。

圖1 胸骨下段腫物

2 實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查

血常規(guī)示：白細(xì)胞計(jì)數(shù)20.21×109/L，血紅蛋白60.60 g/L，中性粒細(xì)胞百分比85.4%。尿常規(guī)示：潛血（+）。肝功能：直接膽紅素19.40 μmol/L，總膽紅素33.40 μmol/L，白蛋白19.6 g/L，球蛋白47.5 g/L，γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶215.0 U/L。腎功能檢測(cè)示：肌酐116 μmol/L，尿酸440 μmol/L。D-二聚體6 436 ng/mL。高敏C反應(yīng)蛋白（全程）210.70 mg/L。降鈣素原2.170 ng/mL。細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定：228.60 pg/mL。真菌β-葡聚糖測(cè)定（G 試驗(yàn)）264.20 pg/mL。副流感病毒抗體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型-IgM 陽性（+）。葡萄糖6-磷酸脫氫酶活性（速率法）1 766 IU。血培養(yǎng)：未培養(yǎng)出細(xì)菌和真菌。腹部及泌尿系超聲：肝大，肝右葉囊腫，脾大，前列腺鈣化灶。骨發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層掃描（emission computed tomography，ECT）：顱骨、胸骨下段、多根肋骨、右側(cè)恥骨、左側(cè)髖臼、左側(cè)坐骨及雙側(cè)肩關(guān)節(jié)骨代謝活躍（圖 2）。顱腦CT：顱骨多發(fā)病灶，符合朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥改變；右頂部軟組織腫脹（圖 3）。胸部CT：雙肺多發(fā)病變，朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥肺部浸潤(rùn)？肺炎？雙肺小葉中心型肺氣腫；胸骨柄下端、兩側(cè)肋骨多發(fā)骨質(zhì)破壞及周圍軟組織腫脹，符合朗格漢斯組織細(xì)胞增生改變（圖 4）。

圖2 全身骨掃描結(jié)果

圖3 頭顱CT結(jié)果

圖4 胸部CT結(jié)果

患者于2020年3月12日行胸骨前壁腫物穿刺檢查，采用Nextseq550 DX測(cè)序平臺(tái)（英國(guó)Illumina公司）行高通量測(cè)序（測(cè)序策略SE75，總測(cè)序核苷酸序列2 000萬條），經(jīng)FastQC軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)基本過濾后去除人相關(guān)reads，剩下的reads與優(yōu)化后其專屬的病原微生物數(shù)據(jù)庫(kù)（包括15 000余個(gè)醫(yī)學(xué)微生物信息）進(jìn)行比對(duì)分析。3月15日病原微生物宏基因檢測(cè)報(bào)告示：馬爾尼菲青霉菌感染。2020年3月15日開始予兩性霉素B脂質(zhì)體10 mg qd治療。2020年3月17日行左鎖骨頭囊性包塊穿刺，抽液后接種在沙氏培養(yǎng)基（本實(shí)驗(yàn)室制備，原料為蛋白胨10 g、瓊脂20 g、葡萄糖40 g、蒸餾水），分別在25和37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)觀察各培養(yǎng)物不同溫度、不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)時(shí)間的菌落形態(tài)及特點(diǎn)。5 d后用透明膠帶先粘取一定量菌絲，再粘在預(yù)先滴加乳酸酚棉蘭染液（本實(shí)驗(yàn)室制備，原料為苯酚、乳酸、甘油、棉藍(lán)、蒸餾水）的載玻片上，顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)、特征、大小、排列等。3月23日顯微鏡下觀察真菌特點(diǎn)符合馬爾尼菲藍(lán)狀菌（25 ℃培養(yǎng)菌落呈青霉相，在高倍鏡下可以看到特征性結(jié)構(gòu)帚狀枝；37 ℃培養(yǎng)菌落呈酵母相，培養(yǎng)物可見圓形或卵圓形的酵母樣菌體），鑒定方法及結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[8]一致。結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查及NGS結(jié)果，最終診斷為播散型馬爾尼菲藍(lán)狀菌?。ǚ巍⒐羌捌つw）。

2 討論

馬爾尼菲藍(lán)狀菌感染起病隱匿，好發(fā)于免疫功能低下或缺陷人群，尤其多見于獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）患者。馬爾尼菲藍(lán)狀菌感染可以侵犯人體多個(gè)系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)主要有發(fā)熱、咳嗽、咳痰、腹痛、腹瀉、淋巴結(jié)及肝脾腫大、貧血、皮膚丘疹或結(jié)節(jié)及骨質(zhì)破壞（罕見）等。本例患者免疫功能正常，既往體健，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、脾大、淋巴結(jié)腫大、皮下膿腫、多發(fā)溶骨性損傷等，但由于臨床癥狀不典型，缺乏特異性，易與結(jié)核病、多發(fā)性骨髓瘤等血液系統(tǒng)疾病相混淆，臨床診斷較困難[7]。另外，隨著AIDS及其他免疫性疾病發(fā)病率的增高，馬爾尼菲藍(lán)狀菌病發(fā)病率逐年上升，病死率較高，因此早期診斷，及早應(yīng)用抗真菌藥物治療是降低病死率的關(guān)鍵。

目前，血液及膿腫穿刺等臨床樣本的微生物培養(yǎng)仍是診斷該病的金標(biāo)準(zhǔn)。但微生物培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，需要1～2周，且樣本取材不易，陽性率較低，導(dǎo)致馬爾尼菲藍(lán)狀菌病早期診斷困難。有文獻(xiàn)報(bào)道馬爾尼菲藍(lán)狀菌可以侵入血液及骨組織，累及骨髓，且取材簡(jiǎn)單、耗時(shí)較短，因此骨髓細(xì)胞學(xué)檢查也是診斷該病的重要方法[3，9]。但目前馬爾尼菲藍(lán)狀菌導(dǎo)致骨損傷較罕見，且程度不一，如本例患者感染后導(dǎo)致骨質(zhì)被破壞，但骨髓細(xì)胞學(xué)及病理檢查未見異常，提示骨髓細(xì)胞學(xué)檢查等傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)存在敏感性差、時(shí)效性差和誤差大等缺點(diǎn)，且往往對(duì)臨床罕見的病原微生物無法識(shí)別。

NGS可直接提取臨床樣本中的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序，將所測(cè)序列與專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，得出樣本中所含病原體的信息，并可直接分析樣本中的病原體譜、豐度及分布情況。與傳統(tǒng)病原體檢測(cè)技術(shù)相比，NGS具有測(cè)序通量高（可檢測(cè)范圍包括基因序列已知的細(xì)菌3 233余種、真菌265余種、病毒4 192余種、寄生蟲及其他病原體274余種）、檢測(cè)時(shí)間短（1～2 d）、敏感性較高、檢測(cè)譜廣（犬咬二氧化碳嗜纖維菌、波瓦桑病毒、豬皰疹病毒等特殊、少見病原體亦可檢出）等優(yōu)點(diǎn)[4，10]，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)未知病原體的快速鑒定，有助于疾病的早期診斷和治療。目前，NGS在臨床中的應(yīng)用正處于發(fā)展階段，仍存在一定的問題，如難以有效分辨致病菌和背景菌，且成本較高。但應(yīng)認(rèn)識(shí)到NGS的臨床價(jià)值，使其成為臨床診斷的有效工具，促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展[11]。

綜上所述，當(dāng)患者出現(xiàn)不明原因的發(fā)熱、貧血、脾大、淋巴結(jié)腫大、皮下膿腫及溶骨性損害時(shí)，應(yīng)高度懷疑特殊病原體感染。臨床工作中，如遇到病原學(xué)診斷不明或高度懷疑特殊病原體感染的患者，使用常規(guī)檢驗(yàn)方法難以有效查出病原體，應(yīng)盡早考慮采用NGS進(jìn)行病原體檢測(cè)，以提高早期診斷準(zhǔn)確率，避免漏診、誤診，降低患者病死率。