茵陳蒿湯對肝癌原位移植瘤小鼠肝臟膽汁酸和腸道微生態的影響*

張玉梅 朱 琳 師 健 張春芳 張辰龍 郭凱航 王玉潔 李鵬飛

肝細胞癌(肝癌)是全球發病率極高的惡性腫瘤之一，發病率為4.7%，位居全球惡性腫瘤第6位，病死率8.3%，位于全球癌癥第3位[1]。中國肝癌發病率和病死率均高于全球平均水平，疾病負擔重。基于“肝臟-膽汁酸-腸道微生態軸”“腸-肝循環”概念，研究人員發現膽汁酸-腸道菌群生理病理相互影響，膽汁酸代謝障礙和腸道微生態之間的失衡參與了肝癌的發生發展[2]。茵陳蒿湯是《傷寒雜病論》中治療濕熱黃疸的著名方，具有保肝、利膽等功效。肝癌屬于中醫“黃疸”“肝積”“癥瘕”等范疇，在治療肝癌的經典方劑中，該方使用頻次位列前3[3]，臨床效果明確但其作用機制尚不清楚。根據中醫“肝與大腸相通”的理論及茵陳蒿提取物促進大鼠膽汁分泌的基礎，筆者推測茵陳蒿湯可能通過平衡膽汁酸代謝-腸道微生態的關系進而控制肝癌的發生發展。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級別雄性 BABL/C 小鼠，30只，體質量18～22 g，購自廈門大學實驗動物中心，許可證號：SYXK(閩)2018-0009。本實驗符合廈門大學實驗動物倫理委員會指導原則和要求，倫理號：XMULAC20200062。

1.2 藥品與試劑茵陳蒿湯(茵陳蒿18 g，生大黃6 g，炒梔子6 g)，飲片購自廈門守一真源健康管理有限公司。將飲片于6倍量水中浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，藥液濃縮至生藥質量濃度分別為0.45 g/ml、0.9 g/ml、1.8 g/ml，4 ℃保存備用。16 S rDNA測序分析技術試劑盒：DNA試劑盒(批號：3302050)、DNA質檢瓊脂糖凝膠(批號：AD1200)、AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(批號：AP-GX-250)、qiagen糞便細菌DNA分離試劑盒(批號：51604)、DNA質檢瓊脂糖(批號：AN34L071)、TransStart Fastpfu DNA Polymerase(批號：JLC-R11648)、PCR建庫試劑接頭引物(批號：TD203)、上機前質檢 qPCR Mix(批號：21612)、qPCR標準品(批號：GF-170F)、TruSeqTM DNA Sample Prep Kit(批號：NT0911-100)，以上均購自上海美吉生物醫藥科技有限公司。

1.3 儀器精密電子天平(Sartorius)，1290 Infinity series UHPLC System 超高液相色譜(Agilent)與Q Exactive Focus 質譜儀(Thermo Fisher Scientific)，MultiskanTMGO酶標儀(Thermo Fisher Scientific)，高速冷凍型離心機(DRAGONLAB)，Forma 8800型超低溫冰箱(賽默飛世爾科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組及建模將小鼠隨機分為假手術組(SOG)、肝癌模型組(MG)、茵陳蒿湯高/中/低劑量組(HDG/MDG/LDG組)，每組6只。模型組和治療組小鼠取濃度2×107個/ml H22肝癌細胞0.1 ml注于肝臟左葉建模，SOG組注入等量生理鹽水。治療組造模后24 h分別予1.8 g/ml、0.9 g/ml、0.45 g/ml茵陳蒿湯1 ml/log小鼠體質量灌胃，MG、SOG組給予等體積生理鹽水，每日上午9:00～10:00給藥1次，連續14 d。

2.2 樣本收集末次給藥24 h后，將小鼠頸椎脫臼處死，將完整肝臟稱重，選取一部分用于HE染色，一部分用于膽汁酸分析。取盲腸末端的內容物置于液氮速凍，-80 ℃保存，用于腸道菌群多樣性分析。

2.3 UHPLC-MS/MS分析①標本預處理：25 mg肝組織樣品中加入1000 μl含0.1% 甲酸提取液(甲醇∶乙腈:水=2∶2∶1，含同位素標記內標)，渦旋混勻30 s；再加入鋼珠，用35 Hz的頻率研磨4 min，再于冰水浴超聲5 min，重復步驟3 次。低溫靜置1 h后在4 ℃離心機中以1 2000 rpm離心15 min；取上清加至LC進樣瓶中，用于UHPLC-MS/MS分析。②流動相條件：Agilent 1290 Infinity series (Agilent Technologies)超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150×2.1 mm,1.7 μm,Waters)液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離。液相色譜A相為1 mmol/L的乙酸銨和1 mmol/L的乙酸水溶液，B相為乙腈。柱溫箱溫度為60 ℃，樣品盤設為4 ℃，進樣體積為1 μl。③質譜條件：使用Q Exactive Focus高分辨質譜儀，以平行反應監測(Parallel Reaction Monitoring,PRM)模式進行質譜分析。離子源參數如下：Spray voltage=3500/-3100 V,Sheath gas (N2) flow rate=40,Aux gas (N2) flow rate=15,Sweep gas (N2) flow rate =0,Aux gas (N2) temperature=350 ℃,Capillary temperature=320 ℃。

2.4 16SrDNA 測序分析菌群多樣性使用DNA提取試劑盒對糞便標本進行細菌DNA提取。以菌群基因中的V3-V4區為靶標，以帶有barcode的引物進行PCR擴增和純化，得到樣本PCR產物。使用熒光定量系統對PCR產物進行檢測定量。構建Miseq文庫，使用Illumina MiSeq PE 300平臺進行Miseq測序，得到菌群V3-V4區的高通量數據。將Miseq測序得到的原始數據進行質量控制，采用PCA分析組間菌群差異、LEfSe分析優勢菌屬。

3 結果

3.1 小鼠肝重比較與SOG組比較，MG組肝重顯著增加(P<0.01)；經茵陳蒿湯干預后，治療組肝重顯著減少且差異有統計學意義，其中高劑量效果最顯著。表明茵陳蒿湯縮小了瘤體，可能具有一定抗腫瘤效果。見圖1。

注：與SOG組比較，***P<0.001；與MG組比較，##P<0.01；與MG組比較，###P<0.001。圖1 茵陳蒿湯對肝癌原位移植瘤小鼠肝臟重量的影響

3.2 HE染色SOG組未見肝癌組織，MG組見大片肝癌組織，且肝癌細胞核深染。LDG、MDG、HDG組均見肝癌組織部分壞死，并且肝癌組織細胞核染色較MG組淺。見圖2。

圖2 肝癌原位移植瘤小鼠肝組織病理(HE * 20 倍)

3.3 膽汁酸代謝差異性分析使用UHPLC-MS/MS分析肝組織中膽汁酸，可測出?；铅潦竽懰?T-α-MCA)、牛磺熊脫氧膽酸(TUDCA)、T-β-MCA、?；悄懰?TCA)、?；敲撗跄懰?TDCA)等。其中各組TUDCA、TCA和TDCA差異均無統計學意義。MG組中T-α-MCA較SOG組顯著降低(P<0.001)。與SOG組相比，MG組的初級結合膽汁酸T-β-MCA濃度顯著降低(P<0.001)，而茵陳蒿湯治療后逐漸升高(P<0.01)。說明茵陳蒿湯可能促進T-β-MCA的生成。見圖3。

注：與SOG 組比較，***P<0.001；與 MG 組比較，##P<0.01；與 MG 組比較，###P<0.001。圖3 茵陳蒿湯對肝癌原位移植瘤小鼠肝組織中膽汁酸的影響

3.4 腸道菌群屬水平分析采用PCA分析不同組別小鼠菌群屬水平的差異性。MG組與SOG組在空間圖中距離較遠，表明二者在屬水平上的菌群物種差異有統計學意義。LDG、MDG、HDG組均與MG組距離較遠，其中MDG組與HDG組在空間分布上顯著與SOG組聚集，表明中高劑量的茵陳蒿湯在恢復肝癌小鼠屬水平上的菌群失調可能有一定的作用。見圖4。

圖4 茵陳蒿湯對肝癌原位移植瘤小鼠腸道菌群 PCA 分析

3.5 優勢菌種差異性分析采用LEfSe分析不同類群的相似性和優勢菌種。SOG組中的優勢菌屬為乳酸桿菌科的乳酸桿菌屬、小鼠桿菌科的小鼠桿菌屬，MG組為螺旋桿菌科的螺旋桿菌屬、毛螺菌科的毛螺菌屬NK4A136和A2芽孢桿菌屬，LDG組為脫硫弧菌科、毛螺菌科的毛螺菌屬，MDG 組為擬桿菌科的擬桿菌屬和另枝菌屬，HDG組為顫螺菌屬和梭狀芽胞桿菌屬。表明MG組和SOG組的優勢菌屬不同，而茵陳蒿湯治療后可以改變優勢菌屬種類的構成，且不同劑量組具有差異性。

4 討論

茵陳蒿湯對肝癌的治療作用得到了臨床的肯定，但是其機制尚未清晰。研究人員發現茵陳蒿湯可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路調控肝癌細胞增殖與凋亡[5]；茵陳提取物對人肝癌HepG2細胞增殖具有抑制作用，并促進細胞凋亡[5]；大黃中的大黃素通過miR-429/SOX2軸調控癌細胞增殖、遷移和侵襲[6]；梔子提取物可能通過下調腫瘤凋亡相關基因bcl-2表達誘導肝癌細胞凋亡[7]。本實驗也證實茵陳蒿湯在體內可能存在抗肝癌的作用。

膽汁酸代謝異常參與了腸道微生態失衡及肝癌的發生發展。膽汁酸是膽固醇在肝細胞中經過一系列的生化反應所形成。鼠類肝細胞中主要合成膽酸和β-鼠膽酸，與牛磺酸結合為TCA和T-β-MCA被肝細胞排入膽管中。初級膽汁酸排放量減少會導致腸道潛在致病菌群增加從而影響腸道微生態。肝癌、肝硬化等慢性肝病過程中產生的初級膽汁酸減少，常伴隨菌群的生態失調[8]。T-β-MCA可促進肝臟CXCR6+自然殺傷T細胞的選擇性增加，發揮抗腫瘤作用[9]。本實驗結果提示茵陳蒿湯可能促進T-β-MCA生成且高劑量效果更佳。

本研究發現，中高劑量的茵陳蒿可使肝癌小鼠的PCA評分與SOG組相近。SOG組中的優勢菌屬為乳酸桿菌屬、小鼠桿菌屬，屬于正常菌屬，具有促消化、提高腸道免疫、拮抗有害菌屬繁殖等作用[10]。MG組中，隨著T-β-MCA排泄減少，優勢菌屬變為螺旋桿菌屬、毛螺菌屬NK4A136和A2菌屬等有害菌。螺旋桿菌可通過門靜脈到達肝臟，激活肝癌細胞的Toll樣受體2，活化腫瘤細胞中有絲分裂原蛋白激酶和NFκB，從而促進腫瘤細胞的增殖和浸潤[11]。NK4A136被視為肝癌早期生物標志物[12]。LDG組中的優勢菌屬為脫硫弧菌科、毛螺菌科的毛螺菌屬。脫硫弧菌被證明可能與肝纖維化有關，其產生的H2S氣體對腸道上皮具有毒性作用[13]。MDG組中的優勢菌屬為擬桿菌屬和另枝菌屬。擬桿菌含有的膽鹽水解酶可促進結合膽汁酸解離，因此可存活在較高濃度的T-β-MCA中。另枝菌屬于革蘭氏陰性菌，大部分耐膽汁[14]。擬桿菌和另枝菌屬都能產生丙酸鹽，門靜脈內的丙酸鹽水平增高可以減少炎癥因子表達，抑制Th17細胞在肝臟中募集，從而抑制肝癌細胞增殖[14]。HDG 組中的優勢菌屬為梭狀芽胞桿菌屬和顫螺菌屬。梭狀芽孢桿菌屬可產生乙酸鹽、丙酸鹽等[15]。顫螺菌屬被視為下一代益生菌的候選者，能夠產生丁酸鹽[16]。丁酸鹽可通過抑制Kupffer細胞中NF-κB的激活來抑制TNF-α、IL-6和髓過氧化物酶活性，從而減少肝臟損傷，甚至抑制肝癌進展[17]。綜上所述，經茵陳蒿湯治療后，各組優勢菌種發生改變，且不同劑量組也存在差異性，這可能與隨著藥物濃度的增加初級膽汁酸排放量逐漸增加有關，不同優勢菌在肝癌發展過程中發揮著不用作用。

綜上所述，茵陳蒿湯可能通過促進初級結合膽汁酸 T-β-MCA 的合成，進而改變腸道優勢菌種，從而發揮治療肝癌的作用。