參苓白術散通過IκBα/NF-κB通路調控Lewis肺癌小鼠腫瘤自噬的研究

張云亭，劉羽茜，蔣宗鎣，張 林，董 秀，馮曉帆，王靖宇，王艷杰

（遼寧中醫藥大學中西醫結合學院 沈陽 110847）

近年來，有關肺癌的防治一直是醫學研究攻克的重點和難點[1]。目前臨床治療肺癌常用的化療藥物主要為抗腫瘤效果顯著、抗腫瘤譜廣的鉑類藥物，但鉑類藥物容易引起嚴重的免疫功能下降、胃腸道功能降低、精神萎靡等毒副作用[2]。中藥因其多靶點效應、毒副作用低、不易產生耐藥性等優勢逐步參與到臨床肺癌的綜合治療當中。臨床研究表明使用培土生金法聯合化療治療非小細胞肺癌能夠提高臨床療效，改善患者生活質量，不良反應較單純化療組明顯減少[3]。

本課題組前期研究發現參苓白術散含藥血清能通過調控 Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）表達有效的抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的SPCA1 肺癌細胞的增殖，說明在體外實驗中參苓白術散能夠通過調控LPS 誘導的炎癥反應，從而抑制肺癌細胞的增殖[4]。炎癥反應貫穿于腫瘤疾病始末的全過程，而自噬的激活能夠抑制促腫瘤的炎癥反應，增強抗腫瘤免疫活性。眾多證據表明[5-6]，細胞自噬可以調節過度的炎癥反應。腫瘤微環境中自噬與免疫的交互作用共同影響著腫瘤發生、進展[7]。參苓白術散等培土生金法中藥復方能夠調節機體免疫功能[8]，但是其是否能夠干預腫瘤微環境中的炎癥反應，從而調控自噬有待進一步研究。因此本實驗通過觀察參苓白術散對肺癌小鼠腫瘤細胞自噬相關蛋白Atg3、Atg5、Beclin-1 和LC3 表達的影響，及其對炎癥相關通路IκBα/NF-κB 通路和促炎因子TNF-α、IL-1β 的含量的影響，為進一步探索參苓白術散聯合順鉑治療肺癌的機制提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 動物

雄性 C57BL/6J 小鼠 40 只，SPF 級，體質量 18-22 g；購于北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號SCXK(京)2016-0002。動物實驗在中國醫科大學實驗動物部進行，動物使用許可證號SYXK(遼) 2015-0001。本研究所涉及的動物實驗部分均符合中國醫科大學實驗動物福利倫理委員會批準，批準號IACUC.2018019。

1.2 主要藥物和試劑

參苓白術散（北京同仁堂有限公司，生產批號16101054）、順鉑（齊魯制藥有限公司，生產批號1W2A1301004B）、TNF-α 和 IL-1β ELISA 試劑盒（美國 ADL 公司）、IκBα、NF-κB、Atg3、Atg5、Beclin-1、LC3B 和二抗（美國Proteintech）、SABC 試劑盒、DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；全蛋白抽提試劑盒、BCA 蛋白含量檢測試劑盒、預染蛋白分子量、SDS-PAGE 凝膠電泳試劑盒、ECL 檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）。

1.3 儀器

YrdimesSW07D0567 蛋白轉印儀（威泰克有限公司），EG1150C 型包埋機，超薄切片機LKB-1，HI1220型烘片機（德國LEICA），JEM-1011BX51 型OLYMPUS顯微鏡（日本OLYMPUS），ELITE300PLUS E5W0541基礎電泳儀電源（威泰克有限公司），5415C 高速冷凍離心機（德國Eppendorf），RM2235 型手動石蠟切片機，THZ-312 臺式恒溫振蕩器（上海精宏實驗設備有限公司），DolphinChemiPlusIDPK1012012 凝膠成像分析系統（威泰克有限公司）。

2 方法

2.1 模型的建立與實驗動物分組

常規培養小鼠肺癌Lewis 細胞（購自中國科學院細胞庫），達到一定數量后收集細胞并計數，制作濃度為 1×107個/mL 的細胞懸液。SPF 級雄性 C57BL/6J 小鼠40 只，每只右側腋窩皮下接種細胞懸液0.1 mL；待腫瘤組織形成后用游標卡尺測定瘤體的瘤長（a）和寬（b），計算腫瘤體積（tumor volume，TV），TV=1/2×a×b2，每日1 次，7 天后待腫瘤體積達到50 mm3視為Lewis 肺癌小鼠模型建立成功。建模成功后隨機分成4 組，每組10 只，分別為模型組、順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組。模型組給予等量蒸餾水灌胃；順鉑組給予腹腔注射順鉑（5 mg·kg-1）每周1 次，共2 次；中藥組按照體表面積折算法進行人和大鼠等效計量換算，給予參苓白術散（9.36 g·kg-1）每天1 次，連續灌胃 14 天；中藥+順鉑組給予參苓白術散（9.36 g·kg-1）每天1次，連續灌胃14 天，同時給予腹腔注射順鉑（5 mg·kg-1）每周 1 次，共2次。

2.2 各組小鼠腫瘤體積、相對腫瘤體積和相對腫瘤增殖率的測定和計算

模型建立成功后和給藥第14 天分別測定小鼠腫瘤長（a）和寬（b），計算腫瘤體積（tumor volume，TV）體積，TV=1/2×a×b2，然后計算相對腫瘤體積（relative tumor volume，RTV），計算公式為 RTV=Vt/V0，其中 V0為模型建立成功后分籠給藥時測量的腫瘤體積，Vt為給藥14天后測量的腫瘤體積，然后計算相對腫瘤增殖率T/C（%），計算公式如下：T/C（%）=TRTV/CRTV×100%,其中TRTV為各治療組RTV，CRTV為Lewis模型組RTV。

2.3 透射電鏡觀察各組腫瘤細胞超微形態變化

取腫瘤組織于干冰上修成1 mm3組織小塊，先放入4%多聚甲醛固定2 h 以上，PBS 沖洗，然后1%鋨酸固定2 h，PBS 沖洗。梯度乙醇、丙酮脫水，包埋，聚合。1 μm半薄切片，甲苯胺藍染色定位，然后超薄切片，檸檬酸鉛-醋酸雙氧鈾雙染，透色電鏡觀察，拍照比較分析。

2.4 ELISA 法測定各組腫瘤組織中TNF-α 和IL-1β的含量

腫瘤組織按照1:9（M:V）加PBS 研磨制備組織勻漿，離心取上清，按照ELISA 試劑盒說明書進行檢測，酶標儀450 nm 處測定各反應孔的吸光度值，并計算TNF-α和IL-1β的含量。

2.5 免疫組化法測定腫瘤組織IκBα 蛋白表達水平和NF-κB的入核率

切片滅活內源性酶，封閉，滴加一抗50 μL，37℃孵育2h，PBS浸洗。滴加二抗，37℃度孵育20 min，PBS浸洗。DAB 溶液顯色，復染，返藍，梯度脫水封片。光學顯微鏡下觀察腫瘤細胞中IκBα 和NF-κB 蛋白的表達水平，細胞質呈棕黃色為IκBα 陽性表達細胞，細胞質和細胞核呈棕黃色為NF-κB 陽性表達細胞，隨機選取3 個視野采用Image J 軟件進行平均光密度測定，取其平均值作為該切片的代表值，并計算NF-κB P65 入核率，即細胞核陽性細胞數占總陽性胞數的百分比，取其平均值作為該切片的代表值。

2.6 Western Blot 法測定腫瘤組織 Atg3、Atg5、Beclin-1和LC3II的蛋白表達水平

腫瘤組織加入1 mL預冷過的Lysis Buffer裂解液，充分研磨，離心分離上清，得到總蛋白提取物，用BCA法進行蛋白定量測定。配制分離膠和濃縮膠，上樣，電泳，然后轉膜，封閉。然后滴加一抗（1:500-1000），4℃搖床振蕩孵育過夜。第二天TBST洗滌，滴加二抗，室溫搖床振蕩1-2 h，TBST 洗膜。采用ECL 化學發光顯色，凝膠成像系統拍照，采用Image J 軟件測定目的蛋白和內參蛋白和條帶的光密度值，計算目的蛋白和內參的光密度比值，進行統計分析。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 參苓白術散對Lewis 肺癌小鼠腫瘤體積、相對腫瘤體積和相對腫瘤增殖率的影響

治療前各組腫瘤體積達到0.05 cm3（50 mm3），提示造模成功，并且各組小鼠腫瘤體積無顯著差異（P＞0.05）；治療結束后，和模型組比較，順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組腫瘤體積和相對腫瘤體積顯著降低（P＜0.01）（表1）。中藥組相對腫瘤增殖率為54.51%，中藥+順鉑組相對腫瘤增殖率為42.31%，順鉑組相對腫瘤增殖率為44.77%，其中中藥+順鉑組相對腫瘤增值率最低，說明中藥聯合順鉑治療抑制腫瘤增殖效果最顯著。

表1 參苓白術散對Lewies肺癌小鼠腫瘤體積和相對腫瘤體積的影響（，n=10）

表1 參苓白術散對Lewies肺癌小鼠腫瘤體積和相對腫瘤體積的影響（，n=10）

注：和模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.2 參苓白術散對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞超微形態的影響

透射電鏡結果顯示模型組腫瘤細胞和細胞核結構清晰，細胞器豐富，可見少量自噬小體，順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組腫瘤組織中細胞體積縮小，細胞核呈不規則形態，自噬小體數量增加（圖1、圖2）。

圖1 各組皮下瘤體

圖2 參苓白術散對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞超微形態的影響

3.3 參苓白術散對腫瘤組織TNF-α 和IL-1β 含量的影響

ELISA 結果顯示（圖3），和模型組比較，順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組腫瘤組織TNF-α 和IL-1β 含量顯著降低（P＜0.01）。和順鉑組比較，中藥組和中藥+順鉑組腫瘤組織TNF-α 和 IL-1β 含量顯著降低（P＜0.01）。說明中藥治療和中藥聯合順鉑治療降低肺癌腫瘤組織中促炎因子TNF-α和IL-1β的含量更顯著。

圖3 參苓白術散對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織TNF-α和IL-1β含量的影響

3.4 參苓白術散對腫瘤組織中IκBα 和NF-κB P65 蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示：IκBα 和 NF-κB 陽性細胞顯示為棕色（圖4）。與模型組相比，順鉑組、中藥組及中藥+順鉑組的腫瘤組織中IκBα 陽性細胞數量顯著增加，平均光密度值顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組的腫瘤組織中NF-κB 陽性細胞數量顯著減少，NF-κB P65 入核率顯著降低（P＜0.01）。說明順鉑、中藥以及中藥聯合順鉑能夠增加 IκBα 的蛋白表達水平，而降低 NF-κB P65 入核率，從而抑制IκBα/NF-κB通路（表2）。

圖4 參苓白術散對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞IκBα和NF-κB P65蛋白表達的影響

表2 參苓白術散對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞IκBα表達和NF-κB入核率的影響（，n=6）

表2 參苓白術散對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞IκBα表達和NF-κB入核率的影響（，n=6）

注：和模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.5 參苓白術散對腫瘤組織中Atg3、Atg5、Beclin-1和LC3蛋白表達的影響

Western blot結果顯示（圖5）：與模型組相比，順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組的腫瘤組織中Atg3、Atg5、Beclin-1 和LC3II/LC3I 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；和順鉑組比較，中藥+順鉑組LC3II/LC3I蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。結果表明參苓白術散能夠增加肺癌組織中 Atg3、Atg5、Beclin-1 和 LC3II/LC3I蛋白表達水平，促進腫瘤細胞自噬，中藥聯合順鉑上調LC3II/LC3I蛋白表達水平作用最顯著。

圖5 參苓白術散對Lewis肺癌小鼠Atg3、Atg5、Beclin-1和LC3蛋白表達的影響

3 討論

肺癌在中醫學范疇內屬“肺積”“結癖”“息責”等，雖然病變的部位是在肺，但發病的原因與脾、肝、腎等臟腑均有關系。肺癌等肺系疾病經日久損耗后，常會出現肺氣不足的情況。脾與肺為母子關系，子盜母氣，則脾氣也會不足，出現脾虛之癥。《黃帝內經》中提到：“虛則補其母，實則瀉其子。”所以可以用補脾益肺的方法治療肺癌。參苓白術散出自《太平惠民和劑局方》，為培土生金方的代表方劑之一。方中人參、茯苓、白術為君藥，蓮子、山藥、白扁豆、薏苡仁為臣藥，君臣合用以滲濕健脾，補脾益肺。砂仁醒脾行氣和胃、暢達氣機；桔梗載藥上行、宣開肺氣；甘草健脾和中、調和藥性，三者共為佐使藥。本方用甘溫藥物補脾，兼能補益肺氣以培土生金，對肺癌中后期造成的肺脾氣虛有顯著療效。目前，參苓白術散已逐漸應用于臨床肺癌的輔助治療[9]，參苓白術散的作用機制也在逐步被研究發現[10-11]。如方中君藥茯苓最主要的活性成分之一茯苓多糖，已被證實具有抗炎、抗腫瘤及提高機體免疫力等作用[12]。方中君藥人參[13-14]的主要活性成分人參皂苷及白術[15]中的活性成分白術內酯等，同樣被實驗研究證明具有抗炎及抗腫瘤等作用。

自噬是真核生物特有的，為了維護細胞內環境穩定所進行的一種程序性細胞死亡，在腫瘤的發生、發展與治療過程中均有體現[16]，是近年的研究熱點。自噬的發生被自噬相關基因嚴格調控[17]。其中beclin-1是形成自噬體過程中的必需基因，同時也是重要的抑癌基因[18]。李璐等[19]研究發現在腫瘤細胞中beclin-1表達量顯著降低，可以通過上調beclin-1 的表達來發揮抑制腫瘤的作用。Atg5 參與自噬泡的形成，在眾多調控自噬的基因中占主要地位，在腫瘤的發生和發展中均有參與[20]。程建超等[21]發現調控Atg5的表達可以抑制肺癌腫瘤生長。Atg3 對LC3 的脂化起重要調節作用。LC3 是自噬發生的標志之一，參與自噬膜的形成并調控溶酶體和自噬體的結合[22]。當自噬發生時，活化后的LC3-I被修飾形成LC3II，經過融合蛋白的轉移后，在自噬體膜上促進自噬體的成熟[23]。LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值，常被作為衡量自噬程度的標準[24]。有研究表明[25]誘導肝癌細胞發生自噬后，腫瘤細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表達水平顯著提高。

NF-κB 是一種誘導性的轉錄調節因子，可以調控基因的轉錄和表達，對細胞的增殖、凋亡、自噬等均有影響[26]。未被激活時，NF-κB 和其相應的抑制蛋白IκB在細胞漿中結合存在。受到外界刺激時，IκB激酶家族通過磷酸化使IκB 從無活性的三聚體中降解出來，從而激活 NF-κB 信號通路[27]。NF-κB 信號通路作為典型的炎癥通路，激活后會持續刺激TNF-α、IL-1β等的表達，引起炎癥反應，促使腫瘤炎性微環境持續存在，促進腫瘤細胞的生成、增殖和轉移[28-29]。NF-κB的激活過程中會出現mTOR 信號通路的激活，進而抑制細胞自噬的發生。有研究表明通過抑制NF-κB 信號通路可以上調自噬蛋白的表達，促進腫瘤細胞發生自噬[30-31]。梁曉暉等[32]通過實驗發現，抑制NF-κB 信號通路中相關蛋白的磷酸化，可以達到促進腫瘤細胞自噬的效果。

本實驗結果顯示，中藥組和中藥聯合順鉑組中TNF-α、IL-1β 的含量均有降低，NF-κB 蛋白表達水平降低，IκBα 蛋白表達水平升高，這提示參苓白術散能夠通過促進IκBα 蛋白的表達，抑制IκB 激酶家族磷酸化，來抑制NF-κB 的激活和炎癥反應的發生。中藥組和中藥聯合順鉑組中 Atg3、Atg5、Beclin-1 和 LC3II/LC3I的表達明顯增加，這提示參苓白術散能夠通過抑制炎癥通路的激活來調控肺癌腫瘤細胞的自噬。

綜上所述，參苓白術散可能通過上調IκBα蛋白表達，抑制NF-κB的激活，改善腫瘤炎性微環境，從而促進Lewis 肺癌小鼠腫瘤細胞自噬。這為臨床上使用參苓白術散進行中西醫結合治療肺癌并降低機體炎癥反應提供了一定的實驗依據。