牛磺酸通過調控miR-126對高糖誘導的大鼠內皮細胞凋亡的影響及其作用機制＊

謝雯雯，何志凌，招煦杰，羅 銳

（廣州中醫藥大學第二臨床醫學院 廣州 510000）

全球糖尿病發病率不斷上升，中國有超過1.5 億的糖尿病患者[1]。 糖尿病是由高血糖引起的慢性疾病，臨床表現為高血糖,可出現多尿、多飲、多食、消瘦，即三多一少癥狀。糖尿病可分為1 型和2 型糖尿病，1型糖尿病主要是由β細胞破壞和胰島素絕對缺乏引起的自身免疫性疾病，2 型糖尿病主要是胰島素抵抗，伴隨攝入過多糖分而導致胰島素分泌不足[2-3]。血管內皮細胞是被覆于血管內膜的一群細胞，代謝活躍且可合成及分泌大量的血管活性物質，對維持血管正常生理功能具有重要作用[4-5]。糖尿病并發癥與血管內皮功能損傷有關。糖尿病是全球性的重大公共衛生問題，嚴重威脅人類健康，因此，亟待研究糖尿病的致病機理，尋找更有效的治療策略。牛磺酸又名牛膽酸、牛膽堿、牛膽素，是中藥牛黃的活性成分。牛磺酸具有防止心血管病的作用，在循環系統中可抑制血小板凝集，降低血脂，保持人體正常血壓和防止動脈硬化；對心肌細胞有保護作用，對降低血液中膽固醇含量有明顯作用[6-8]。牛磺酸可顯著降低糖尿病大鼠的血糖水平，減輕胰島素抵抗，改善功能失調的神經傳導[9]。miRNA 是一類由內源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，它們在動植物中參與轉錄后基因表達調控。有研究表明，miRNA 在血管內皮細胞中有一定程度的表達，且對細胞的生長修復起到極其重要的調節作用[10-11]。miR-126 表達水平降低參與了胰島素抵抗及2 型糖尿病的發生和發展[12]。miR-126 表達降低與妊娠期糖尿病患者的胰島素抵抗相關[13]。1 型糖尿病患者血漿中miR-126 呈低表達，miR-126 參與了1 型糖尿病患者的炎癥反應及脂質代謝異常，且其水平隨年齡增長而下降[14]。過表達miR-126 可促進高糖誘導的人視網膜內皮細胞HREC 增殖，并抑制其凋亡[15]。盡管已有研究發現牛磺酸、miR-126 對糖尿病具有一定緩解作用，但牛磺酸是否可通過調控miR-126 表達緩解糖尿病細胞損傷還尚未可知。研究表明，急、慢性的高糖狀態可抑制血管內皮細胞生長，并誘發內皮細胞的凋亡，從而加重血管內皮損傷[16-17]。本實驗主要探討牛磺酸通過調控miR-126對高糖誘導的大鼠內皮細胞凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

牛磺酸購自Sigma 公司；大鼠胸主動脈內皮細胞購自美國ATCC 細胞庫；細胞培養DMEM 培養基購自HyClone 公司；miR-126 模擬物和抑制物購自北京華大基因公司；細胞計數試劑盒（CCK-8）購自南京凱基公司；膜聯蛋白V（Annexin-V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Cell signaling technology 公司；Cleaved-caspase3、Procaspase3一抗及二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。逆轉錄試劑盒、SYBR Green master mix 購自北京寶日醫生物技術公司。二氧化碳培養箱購自美國Thermo 公司；ABI7500 熒光定量 PCR 儀購自美國 ABI公司；酶標儀購自德國Eppendorf 公司；BG-sub MIDI型多用途水平電泳儀購自美國Baygene公司。

1.2 細胞培養和實驗分組

大鼠胸主動脈內皮細胞在DMEM 培養基（含10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素）和細胞培養箱（37℃、5%CO2）中培養和傳代。待細胞貼壁生長至約80%融合時，更換培養基對細胞做12 h 的饑餓處理（培養液中的血清濃度從10%降到無血清或2%，使培養液因缺乏血清中的生長因子而不能使細胞分裂），之后加藥干預。細胞分組和處理如下：NC 組（用5.5 mmol·L-1葡萄糖培養基培養）、HG 組（用含30.0 mmol·L-1葡萄糖培養基培養24 h）、HG+低濃度牛磺酸組、HG+中濃度牛磺酸組和HG+高濃度牛磺酸組（分別用含5.0、10.0、20.0 μmol·L-1牛磺酸和含30.0 mmol·L-1葡萄糖的培養基培養24 h）。miR-NC+HG 組、miR-126+HG 組、anti-miR-NC+HG 組、anti-miR-126+HG 組分別將 miR-NC、miR-126 mimics、anti-miR-NC、antimiR-126 轉染至大鼠胸主動脈內皮細胞（用含30.0 mmol·L-1葡萄糖培養基轉染細胞24 h）；牛磺酸+antimiR-NC+HG 組、牛磺酸+anti-miR-126+HG 組分別將anti-miR-NC、anti-miR-126 轉染大鼠胸主動脈內皮細胞（用含30.0 mmol·L-1葡萄糖和20.0 μmol·L-1牛磺酸培養液轉染細胞24 h）。

1.3 CCK-8法檢測細胞活力

將各組細胞培養24 h 后，每組取100 μL 密度為5×103/mL 的大鼠胸主動脈內皮細胞，每孔加入10 μL的CCK-8 溶液，二氧化碳培養箱孵育2 h 后。用酶標儀測定各孔在450 nm 處吸光度（A）值，各實驗組設置3 個復孔，細胞活性( %) =（A對照組-A實驗組）)/ A對照組×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率

取各組大鼠胸主動脈內皮細胞加入預冷PBS 洗滌，4 ℃條件下經3000 r·min-1離心6 min，棄上清，收集細胞沉淀，向細胞沉淀中加入500 μL 結合緩沖液，加入 5 μL Annexin V-FITC 與 5 μL PI，室溫振蕩孵育 10 min，應用 FACS Calibur 流式細胞儀及應用 Cellauest 軟件檢測各組細胞凋亡率。

1.5 RT-qPCR檢測miR-126的表達水平

各組細胞培養48 h，提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒降RNA 合成cDNA，按照SYBR Green master mix試劑盒說明進行PCR，反應條件為95℃2 min，95℃15 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共 40 個循環。相對表達量用2-△△Ct法計算。miR-126分別U6為內參，miR-126上游引物：5’-TACTTTTGGTACGCGCTGTG-3’，下游引物：5’-GCTAGCTACGATCACACTACG-3’；U6 上游引物：5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.6 Western blot 檢測 Cleaved-caspase3、pro-caspase3蛋白表達

各組大鼠胸主動脈內皮細胞中加入400 μL RIPA裂解液，提取細胞總蛋白，采用BCA 法檢測蛋白濃度，蛋白變性，采用SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉膜、封閉2 h，分別孵育一抗稀釋液（稀釋比1:1000，條件：4℃孵育24 h）與二抗稀釋液（稀釋比1:2000，條件：室溫孵育1 h），滴加ECL，暗室內曝光顯影，應用ImageJ 軟件分析各條帶灰度值。

1.7 統計學分析

采用SPSS 22.0 進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（）表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 牛磺酸對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞活性的影響

由表1可知，與NC組比較，HG組大鼠胸主動脈內皮細胞活性顯著降低（P＜0.05）；與HG 組比較，HG+低濃度牛磺酸組、HG+中濃度牛磺酸組、HG+高濃度牛磺酸組大鼠胸主動脈內皮細胞活性顯著升高（P＜0.05）。

表1 牛磺酸對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞活性的影響（，n=9）

表1 牛磺酸對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞活性的影響（，n=9）

注：與NC比較，*P＜0.05；與HG比較，#P＜0.05。

吸光度（A）值0.982±0.08 0.387±0.03*0.632±0.06#0.766±0.07#0.856±0.08#組別NC HG HG+低濃度牛磺酸組HG+中濃度牛磺酸組HG+高濃度牛磺酸組藥物濃度5.0 μmol·L-1 10.0 μmol·L-1 20.0 μmol·L-1細胞活性99.88±10.65 36.58±3.68*68.96±5.58#76.98±6.31#85.62±8.80#

2.2 牛磺酸對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞凋亡的影響

由表 2 和圖 1、2 可知，與 NC 組比較，HG 組大鼠胸主動脈內皮細胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達顯著上升，Pro-caspase3 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與HG 組比較，HG+低濃度牛磺酸組、HG+中濃度牛磺酸組、HG+高濃度牛磺酸組大鼠胸主動脈內皮細胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達顯著降低，Pro-caspase3蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。

表2 牛磺酸對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞凋亡的影響（，n=9）

注：與NC比較，*P＜0.05；與HG比較，#P＜0.05。

Pro-caspase3 蛋白0.89±0.09 0.29±0.02*0.41±0.04#0.53±0.05#0.67±0.07#組別NC HG HG+低濃度牛磺酸組HG+中濃度牛磺酸組HG+高濃度牛磺酸組藥物濃度5.0 μmol·L-1 10.0 μmol·L-1 20.0 μmol·L-1凋亡率（%）7.44±0.69 35.61±5.80*20.37±2.89#13.85±1.94#10.69±1.07#Cleaved-caspase3 蛋白0.25±0.03 0.85±0.08*0.66±0.06#0.51±0.05#0.43±0.04#

圖1 牛磺酸對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞凋亡的影響凋亡圖

2.3 牛磺酸對miR-126表達的影響

由表3可知，與NC組比較，HG組大鼠胸主動脈內皮細胞中miR-126 表達顯著降低（P＜0.05）；與HG 組比較，HG+低濃度牛磺酸組、HG+中濃度牛磺酸組、HG+高濃度牛磺酸組大鼠胸主動脈內皮細胞中miR-126表達顯著升高（P＜0.05）。

表3 牛磺酸對miR-126表達的影響（，n=9）

表3 牛磺酸對miR-126表達的影響（，n=9）

注：與NC比較，*P＜0.05；與HG比較，#P＜0.05。

miR-126表達水平1.01±0.09 0.36±0.03*0.64±0.06#0.77±0.07#0.86±0.08#組別NC HG HG+低濃度牛磺酸組HG+中濃度牛磺酸組HG+高濃度牛磺酸組藥物濃度5.0 μmol·L-1 10.0 μmol·L-1 20.0 μmol·L-1

2.4 過表達miR-126對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞活性、凋亡的影響

圖2 牛磺酸對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞凋亡的影響蛋白圖

由表 4 和圖 3 可知，與 HG+miR-NC 組比較，HG+miR-126組大鼠胸主動脈內皮細胞中miR-126表達顯著升高，細胞活性、Pro-caspase3 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；凋亡率、Cleaved-caspase3 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。

表4 過表達miR-126對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞活性、凋亡的影響（，n=9）

表4 過表達miR-126對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞活性、凋亡的影響（，n=9）

注：與HG+miR-NC比較，*P＜0.05。

Pro-caspase3蛋白0.30±0.03 0.88±0.08*108.643 0.000組別HG+miR-NC HG+miR-126 t P miR-126表達水平1.00±0.10 2.29±0.18*98.324 0.000細胞活性（%）34.61±2.81 81.07±7.20*112.084 0.000吸光度（A）值0.392±0.03 0.841±0.09*101.965 0.000凋亡率（%）37.51±4.22 11.39±1.25*85.641 0.000 Cleaved-caspase3蛋白0.91±0.09 0.45±0.04*82.014 0.000

圖3 過表達miR-126對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞凋亡相關蛋白表達的影響

2.5 低表達miR-126可以逆轉牛磺酸對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞活性、凋亡影響

由表5 和圖4 可知，與HG+牛磺酸組和HG+牛磺酸+ anti-miR-NC 組比較，HG+牛磺酸+ anti-miR-126組大鼠胸主動脈內皮細胞中miR-126 表達顯著降低，細胞活性、Pro-caspase3 蛋白表達顯著降低，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。

圖4 低表達miR-126 可以逆轉牛磺酸對HG 處理的大鼠胸主動脈內皮細胞凋亡相關蛋白表達的影響

表5 低表達miR-126可以逆轉牛磺酸對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞活性、凋亡的影響（，n=9）

表5 低表達miR-126可以逆轉牛磺酸對HG處理的大鼠胸主動脈內皮細胞活性、凋亡的影響（，n=9）

注：與HG+牛磺酸比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC+HG+牛磺酸，#P＜0.05。

Pro-caspase3蛋白0.89±0.09 0.88±0.08 0.31±0.04*#組別HG+牛磺酸HG+牛磺酸+anti-miR-NC HG+牛磺酸+anti-miR-126藥物濃度20.0 μmol·L-1 20.0 μmol·L-1 20.0 μmol·L-1 miR-126表達水平1.03±0.10 0.99±0.09 0.37±0.03*#細胞活性（%）85.21±9.20 84.28±5.55 34.28±2.16*#吸光度（A）值0.851±0.08 0.388±0.03 0.393±0.04*#凋亡率（%）10.62±0.82 11.29±1.00 36.54±3.85*#Cleaved-caspase3蛋白0.42±0.04 0.43±0.03 0.89±0.08*#

3 討論

牛磺酸具有多種生理活性。研究表明，牛磺酸可緩解多種細胞損傷。如牛磺酸可通過調控Keap1-Nrf2 通路關鍵基因的表達和抑制氧化應激來減輕棕櫚酸誘導的胰島素抵抗細胞模型損傷[18]。牛磺酸可通過抑制內質網應激活化顯著改善胡蘿卜素誘導的人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y 損傷[19]。牛磺酸預處理可顯著降低脂多糖引起的奶牛肝臟原代細胞BHEC炎癥反應[20]。牛磺酸處理對百草枯誘導的帕金森小鼠模型損傷具有緩解作用[21]。牛磺酸可抑制白介素誘導的大鼠椎間盤退變模型髓核細胞的凋亡、炎癥和氧化應激[22]。糖尿病的病理機制非常復雜，受高血壓、非酶糖化、血脂異常、腎血流動力學改變、氧化應激和細胞因子等多種因素影響[23]。糖尿病發病時糖脂代謝紊亂，血管緊張素Ⅱ釋放增加，均可刺激活性氧產生而損傷血管內膜，引起內皮細胞凋亡，進而促進血管病變的發生[24-25]。牛磺酸不僅參與維持機體內環境的穩態，而且對多種組織細胞有明顯的保護作用。研究顯示，牛磺酸能預防高糖誘導的內皮細胞凋亡，其抗凋亡效應與降低細胞內活性氧簇和穩定細胞內鈣水平相關[26]。miRNAs 廣泛參與了機體多種生理病理過程的調控，miRNAs已成為生命科學研究領域的熱點[27-28]。

細胞凋亡是程序性細胞死亡，是為維持內環境穩定由基因控制的細胞自主死亡。Caspase 蛋白家族廣泛存在于細胞質中，參與調控細胞凋亡過程，Caspase 3 的激活標志著細胞凋亡進入不可逆階段[29]。本實驗研究發現，高糖誘導的大鼠胸主動脈內皮細胞活性顯著降低；但牛磺酸顯著升高高糖誘導組大鼠胸主動脈內皮細胞活性。高糖誘導的大鼠胸主動脈內皮細胞凋亡率、Cleaved-caspase3 蛋白表達顯著上升，Procaspase3 蛋白表達顯著降低；但牛磺酸顯著降低糖誘導的大鼠胸主動脈內皮細胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達，顯著升高Pro-caspase3 蛋白表達。說明，牛磺酸提高高糖誘導的大鼠內皮細胞活性，并促進凋亡。有類似的研究表明，牛磺酸能抑制內皮細胞氧化應激，減少細胞凋亡，對防治糖尿病并發血管疾病具有重要臨床意義[30]。梁棟等[31]研究表明，牛磺酸通過激活PI3K/Akt 信號通路抑制高糖誘導的內皮細胞凋亡。

本研究發現，高糖誘導的大鼠胸主動脈內皮細胞中miR-126 表達顯著降低；但牛磺酸顯著升高大鼠胸主動脈內皮細胞中miR-126 表達。說明，牛磺酸提升了高糖誘導的大鼠內皮細胞miR-126 表達。有類似研究發現，miR-96-5p 在高糖誘導的脈絡膜視網膜內皮細胞應激中表達顯著下調[32]。miR-126 可通過NF-κB 信號通路減輕膿毒癥大鼠腦損傷[33]。miR-126 通過促進歸巢和維持晚期生長內皮祖細胞的干性來緩解血管損傷[34]。外泌體來源的miR-126可降低急性心肌梗塞缺血/再灌注損傷引起的氧化應激和凋亡[35]。miR-126-3p 在小鼠纖維化腎臟和心臟組織中下調，miR-126-3p 過表達可抑制內皮細胞向間充質細胞轉化[36]。

本實驗研究顯示，HG+miR-126 組大鼠胸主動脈內皮細胞中miR-126 表達顯著升高，細胞活性、Procaspase3 蛋白表達顯著升高；凋亡率、Cleavedcaspase3 蛋白表達顯著降低。HG+牛磺酸+anti-miR-126 組大鼠胸主動脈內皮細胞中miR-126 表達顯著降低，細胞活性、Pro-caspase3 蛋白表達顯著降低，凋亡率、Cleaved-caspase3 蛋白表達顯著升高。說明，牛磺酸通過上調miR-126 表達促進高糖誘導的大鼠內皮細胞凋亡。

綜上所述，牛磺酸通過上調miR-126 抑制了高糖誘導的大鼠內皮細胞凋亡，為治療糖尿病提供了理論依據。本論文的創新點主要在中藥通過調控非編碼RNA的表達來促進細胞凋亡，抑制增殖。