紫朱軟膏治療非缺血型糖尿病足潰瘍的臨床療效及對血清中Th1/Th2細胞的影響＊

黃仁燕，閆少慶，楊 曉，王麗翔，胡嘯明，柳國斌

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院 上海 201203）

糖尿病（Diabetes，DM）作為人類健康威脅最大的四大慢性疾病之一，后期常合并神經、血管病變，涉及多個組織器官，尤其以足部病變多見[1]。糖尿病足致殘率高，糖尿病足潰瘍（Diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病患者截肢的主要原因[2-4]。糖尿病足潰瘍作為慢性難愈性潰瘍，其發病機制、愈合機制已成為研究的重難點。隨著相關研究的深入，2 型糖尿病也可能是一種自身免疫性疾病以及糖尿病足的發生可能與免疫相關的觀點逐漸興起。2 型糖尿病（Type 2 Diabetes）患者長期處于慢性炎癥狀態，改變了機體炎癥細胞水平。有研究指出與正常健康者相比，糖尿病患者血清中的輔助性T 細胞（helper T lymphocyte1，Th1）細胞比例以及Th1/Th2 比例呈升高現象，糖尿病潰瘍患者存在T 淋巴細胞免疫紊亂[5]。炎癥反應期促炎因子與抑炎因子之間相互平衡從而參與免疫應答。Th1、Th2作為兩個亞型分別是促炎因子和抑炎因子的關鍵調節因子[6]。因此調節機體免疫紊亂是糾正糖尿病足潰瘍患者慢性炎癥狀態的關鍵因子。

糖尿病足潰瘍屬于中醫“脫疽”“筋疽”范疇，因虛感邪（濕、熱、毒）、邪氣致瘀為基本病因病機[7]。因此在治療上堅持“扶正祛邪”并用。針對糖尿病足潰瘍目前治療主要以綜合治療為主，在內科治療的基礎上結合局部治療，局部更加注重外治[8]。紫朱軟膏是我院我科通過長期臨床實踐總結的治療糖尿病潰瘍的外用藥，主要藥物包括紫草、朱砂、黃芪、血竭、阿膠、冰片，其中朱砂、紫草為君藥，全方具有祛腐生肌、補氣益血、清熱解毒之功，秉承了扶正、祛邪并用的治療思想[9]。在前期作用機制的研究中發現紫朱軟膏在糖尿病足潰瘍治療中能有效抑制炎癥因子表達[10]。Th1、Th2 作為炎癥反應關鍵調節因子，因此我們推測紫朱軟膏治療糖尿病足潰瘍可能是通過調節Th1/Th2細胞從而抑制炎癥因子表達實現的。因此預通過本研究觀察紫朱軟膏是否通過Th1/Th2 細胞發揮促進潰瘍愈合的作用。

1 臨床資料

1.1 納入標準

符合糖尿病診斷標準（2017 年版）[11]；《糖尿病足筋疽單病種質量控制標準》《現代糖尿病診斷治療學》中非缺血型糖尿病足診斷標準[12]；符合糖尿病足Wagner 分期 2-4 級[13]；年齡 40-80 歲；簽署知情同意書者。

1.2 排除標準

年齡小于40 歲或大于80 歲者；缺血型糖尿病足潰瘍者；資料不全者；嚴重心肝腎功能不全者；惡性腫瘤者；患自身免疫性疾病者；其他原因引起的神經、血管病變者；3 個月內有糖尿病酮癥、酮癥酸中毒以及重度感染者；外科或介入血管形成術治療者；入選前4周曾參加其他臨床試驗者；對治療方案中相關藥物過敏，不適合接受本治療方案者。

1.3 脫落、中止標準

不符合納入標準而被納入者；納入研究后未接受任何治療者；治療過程中發展為缺血型糖尿病足，需要介入治療者；發生嚴重不良反應，不宜繼續進行治療者；因自身其它原因提出退出研究者；失訪者。凡符合上述任意1項者，均列為脫落病例。

1.4 一般資料

收集 2019 年 12 月至 2020 年 12 月就診于上海中醫藥大學附屬曙光醫院周圍血管病科的非缺血型糖尿病足潰瘍患者104 例，采用隨機數字表法分為試驗組和對照組各52 例。兩組一般資料比較均無統計學差異（P＞0.05），具有可比性（表1）。

表1 兩組一般資料比較

2 方法

2.1 干預措施

兩組患者均嚴格按照《中國2型糖尿病防治指南》給予基礎治療[14]：健康宣教、降糖、降壓、控制血脂糾正低蛋白血癥、電解質紊亂、控制感染。試驗組局部潰瘍外用雙氧水、0.9%氯化鈉溶液沖洗后，采用紫朱軟膏紗條填充。對照組局部潰瘍采用常規外治方案，外用雙氧水、0.9%氯化鈉溶液沖洗后，外用藻酸鈣敷料（商品名：德濕康，保赫曼（上海）貿易有限公司，10 cm×10 cm）。兩組患者均每日換藥1 次，連續治療8周。

2.2 觀察指標與方法

2.2.1 臨床療效觀察

治療8 周后，對比兩組患者足部潰瘍面積較治療前變化情況，根據《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》[15]評估兩組臨床療效。治愈：臨床癥狀消失，創面完全愈合；顯效：臨床癥狀明顯好轉，創面2/3 以上愈合；有效：臨床癥狀好轉，創面1/2 以上愈合；無效：達不到有效標準者。

2.2.2 血清中Th1/Th2相關細胞因子水平比較

于治療前及治療8周后，采集患者空腹血，記錄兩組患者血清細胞因子水平（Th1相關細胞因子：腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN- γ）；Th2 相 關 細 胞 因 子 ：白 細 胞 介 素 -4（interleukin-4，IL-4）、白細胞介素-5（interleukin-5，IL-5）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10），并比較兩組之間的差異及治療前后差異。所有血液檢測由上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科進行。

2.2.3 肝腎功能水平比較

于治療前及治療8周后，采集患者空腹血，記錄兩組患者天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate amino transferase, AST）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase, ALT）、血清肌酐（serum creatinine,Scr）、尿素氮（Blood Urea Nitrogen, BUN）水平，并比較兩組之間的差異及治療前后差異。所有血液檢測由上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科進行。

2.3 統計學方法

應用SPSS 21.0 統計學軟件分析處理。計量資料符合正態性、方差齊性時采用均數±標準差（）描述，不符合以上條件時，采用中位數及四分位間距M（Q1，Q3）描述；計數資料及等級資料采用頻數或百分率描述。組間比較，計數資料采用卡方檢驗；等級資料采用非參數秩和檢驗；計量資料符合正態性、方差齊性時，采用T 檢驗；不符合以上條件，采用非參數秩和檢驗。組內比較，計量資料符合正態性、方差齊性時，采用配對樣本T 檢驗；不符合以上條件，采用非參數秩和檢驗。P＜0.05 表示有統計學差異，P＜0.01 表示有顯著性統計學差異。

3 結果

3.1 臨床療效比較

試驗組治愈率30.77%（16/52）、顯效率61.54%（32/52）、有效率7.69%（4/52）；對照組治愈率25.0%（13/52）、顯效率42.31%（22/52）、有效率32.69%（17/52）。兩組臨床療效比較具有統計學差異，試驗組優于對照組（Z=-2.183，P＜0.05）（表2）。

表2 兩組臨床療效比較（n，%）

3.2 兩組血清中Th1/Th2相關細胞因子水平比較

治療前，兩組TNF-α、IL-2、INF-γ 水平均處于非正常值范圍，組間比較無統計學。治療8周后，試驗組TNF-α 平均水平為5.20（4.20，6.70），對照組TNF-α 平均水平為7.30（6.50，7.90），兩組組間比較具有統計學差異（Z=-5.622，P＜0.05）；試驗組 IL-2 平均水平為6.30（4.75，6.88），對照組 IL-2 平均水平為 6.50（5.40，7.50），兩組組間比較具有統計學差異（Z=-2.434，P＜0.05）；試驗組IL-4 平均水平為6.40（5.53，7.30），對照組IL-4 平均水平為5.75（4.53，6.75），兩組組間比較具有統計學差異（Z=-2.449，P＜0.05）；試驗組IL-10平均水平為 8.50（7.33，9.45），對照組 IL-10 平均水平為7.40（6.40，8.48），兩組組間比較具有統計學差異（Z=-3.024，P＜0.05）（表3）。

表3 兩組患者Th1/Th2細胞水平比較（M（Q1，Q3），%）（pg·mL-1）

血清中細胞因子治療前后差值結果顯示兩組患者血清中TNF-α、IL-2、INF-γ水平呈下降趨勢，IL-4、IL-5、IL-10 水平呈上升趨勢。組間比較，試驗組患者血清 TNF-α 治療前后平均差值為-4.25（-6.55，-2.55），對照組患者血清TNF-α 治療前后平均差值為-1.65（-3.05，-1.30），試驗組小于對照組，具有顯著統計學差異（Z=-5.271，P＜0.01）；試驗組患者血清IL-2 治療前后平均差值為-3.0（-5.53，-2.10），對照組患者血清IL-2 治療前后平均差值為-2.05（-4.58，-1.0），試驗組小于對照組，具有顯著統計學差異（Z=-2.104，P＜0.01）（表4）。

表4 兩組血清中Th1/Th2相關細胞水平治療前后差值（M（Q1，Q3），%）（pg·mL-1）

3.3 兩組肝腎功能比較

治療前，兩組患者肝腎功能（AST、ALT）比較，均無統計學差異（P均＞0.05）。治療8 周后，組內比較，兩組患者肝腎功能（AST、ALT）指標較治療前均無統計學差異（P均＞0.05）；組間比較，兩組患者肝功能（AST、ALT）指標均無統計學差異（P均＞0.05）（表5）。

表5 兩組肝腎功能比較（M（Q1，Q3），U·L-1）

4 討論

初始CD4+T 細胞分化成為Th 細胞[16]。在多種因素誘導下Th0 選擇性向Th1 或Th2 細胞偏移、分化。Th1 細胞能合成干擾素（interferon，IFN）-γ、腫瘤壞死因 子（tumor necrosis factor，TNF）-α 以 及 白 介 素（interleukin，IL）-2 等，在防御胞內病原體時發揮了至關重要的作用[17]。IFN-γ 等可募集活化炎性細胞，因此Th1 細胞與炎癥反應、組織損傷密切相關。Th2 能合成 IL-4、IL-5、IL-10、轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β 等，其中IL-4可以抑制IFN-γ對巨噬細胞的活化作用，IL-10 可直接抑制巨噬細胞功能，因此Th2 細胞主要發揮抗炎作用[18]。正常情況下，炎癥反應早期以Th1 反應為主，后會出現逐漸增強的Th2反應，以阻止Th1反應介導的損傷[19]。因此當機體出現Th1/Th2 免疫失衡時，可能會引起炎癥反應紊亂。目前糖尿病足潰瘍難愈合的具體機制尚不明確。有研究發現糖尿病潰瘍在愈合過程中存在炎癥反應延遲以及失調[20]。

糖尿病足潰瘍屬于中醫“脫疽”“筋疽”范疇，治療上堅持“扶正祛邪”并用。針對糖尿病足潰瘍目前治療主要以綜合治療為主，在內科治療的基礎上結合局部治療，局部更加注重外治[21，22]。紫朱軟膏是由朱砂、紫草、黃芪、血竭、阿膠、冰片六味中藥加上輔料制備成的外用油膏制劑。六藥合用具有祛腐生肌、補氣益血、清熱解毒之功。其中朱砂又名丹砂、辰砂，是一種天然礦物藥，主要成分為硫化汞。其味甘、性微寒，具有清熱解毒之效，臨床上朱砂常與冰片合用治療癰疽瘡瘍[23]。紫草味甘咸、性寒，具有清熱涼血、活血解毒之功，常與血竭配伍治療瘡瘍久潰不斂及濕疹[23]。紫草在《本經》記載其有：“利九竅，通水道。”之用，同時又有“補益中氣”之功。《仁齋直指方》謂其可治癰疽。血竭味甘咸、性平，具有活血散瘀、定痛止血、斂瘡生肌功效，外用可治瘡瘍久潰難斂之癥[23]。血竭《唐本草》記載有：“止痛，破積，金創生肉。”《海藥本草》謂其可治一切內傷及疼痛。黃芪味甘、性溫。在《本草綱目》中記載：“黃芪甘溫純陽，其用有五：補諸虛不足，一也；益元氣，二也；壯脾胃，三也；去肌熱，四也；排膿止痛，活血生血，內托陰疽，為瘡家圣藥，五也。”黃芪具有補氣托毒排膿生肌之功，可用于瘡瘍治療[23]。阿膠味甘、性平，具有補益氣血之效，常以內服為主。阿膠據《綱目》記載治“一切癰疽腫毒”，有“和血滋陰”之功效。冰片又名龍腦、梅片、結片，味苦、性寒，具有清熱解毒、生肌斂瘡之功，常與血竭同用治療瘡瘍潰后日久不斂[23]。綜上，紫朱軟膏全方具有清熱解毒、祛腐生肌、補益氣血的功效，符合糖尿病足潰瘍扶正祛邪的治療理念。從臨床藥理學研究來看，紫草中有效成分紫草多糖可抑制炎性因子TNF-α 轉錄[24]。黃芪中黃芪多糖可調控Th1/Th2 平衡，改善機體免疫水平[25]。血竭中血竭總黃酮能顯著提高小鼠脾淋巴細胞增殖能力[26]。阿膠對Th1/Th2 細胞因子平衡具有調節作用[27]。冰片具有抗炎作用，其可能與調控Th1/Th2 細胞免疫減少炎癥介質堆積相關[28]。另外在前期的臨床研究中發現紫朱軟膏聯合中醫外治技術治療Wagner2-4 級糖尿病足潰瘍有效率達88.89%，除了能促進局部潰瘍愈合外，還能有效減少局部潰瘍膿液量，改善局部肉芽顏色、降低潰瘍周圍皮溫以及減輕患者疼痛感[29]，但其作用機制尚不明確。另外紫朱軟膏可貫穿于糖尿病足潰瘍整個治療過程中。如糖尿病足潰瘍早期在治療上以祛邪為主，紫朱軟膏具有清熱解毒之效，用于早期治療能有效控制創面濕熱毒邪；糖尿病足潰瘍中期治療上以生肌為主，紫朱軟膏具有祛腐生肌作用，用于中期治療能使創面腐肉組織去除的同時促進新鮮肉芽生長，有效縮短創面愈合時間；糖尿病足潰瘍后期治療上以生肌長皮為主，紫朱軟膏具有補益氣血功效，在后期治療中應用，為創面提供營養，促進上皮化。

本項研究結果表明紫朱軟膏相對于藻酸鈣敷料而言，在非缺血型糖尿病足潰瘍的治療上臨床療效更為顯著。治療前兩組患者血清中細胞因子水平在TNF-α、IL-2、INF-γ 處于非正常值范圍，呈升高表現。TNF-α、IL-2、INF-γ 均為多效性細胞因子，廣泛參與機體免疫反應、炎癥反應中，它們在糖尿病足潰瘍中處于高表達狀態，表明糖尿病足潰瘍患者處于炎性反應狀態，這符合糖尿病足潰瘍存在炎癥反應失調、延遲的觀點。TNF-α、IL-2、INF-γ 主要由Th1 細胞所分泌，均為促炎細胞因子。因此提示在糖尿病足潰瘍早期可能存在炎癥反應失調。從治療后兩組患者細胞因子檢測水平來看，兩組所有觀察指標均處于正常值范圍內。治療后細胞因子檢測結果顯示兩組在TNF-α、IL-2、INF-γ 較治療前明顯降低，在IL-4、IL-5 上均較治療前明顯上調，對照組在IL-10 上治療前后無明顯差異。組間比較結果顯示試驗組與對照組在TNF-α、IL-2、IL-4、IL-10 中存在表達差異，試驗組的TNF-α、IL-2 表達水平低于對照組，而試驗組的IL-4、IL-10表達水平上高于對照組。細胞因子治療前后差值結果顯示試驗組在TNF-α、IL-2 治療前后差值上與對照組有明顯差異，紫朱軟膏下調TNF-α、IL-2 表達更為明顯。TNF-α、IL-2 主要由 Th1 細胞所分泌，而 IL-4、IL-10 主要由Th2 細胞所分泌。研究表明一方面紫朱軟膏在糖尿病足潰瘍治療中能降低炎癥反應，另一方面說明紫朱軟膏可下調Th1、上調Th2 表達作用，間接表明紫朱軟膏對Th1/Th2 細胞分化具有調節作用。因此，推測紫朱軟膏治療糖尿病足潰瘍的作用機制可能在于通過抑制Th1 細胞分化偏倚，降低機體炎癥反應水平，改善糖尿病足潰瘍慢性炎癥狀態，促進潰瘍愈合。這也間接說明紫朱軟膏具有扶正（調節免疫細胞，改善免疫紊亂）、祛邪（降低炎癥反應水平）的作用。

Th1/Th2 細胞分化在炎癥反應中具有重要的免疫調節機制，但在糖尿病潰瘍愈合過程中的機制尚未闡明。本研究從Th1/Th2 細胞分化角度出發研究中藥紫朱軟膏的作用機制，為中醫藥以及“扶正祛邪”中醫理論治療糖尿病潰瘍提供科學依據。通過本次研究發現紫朱軟膏治療非缺血型糖尿病足潰瘍有效，且對患者血清中Th1/Th2 細胞具有調節作用，從而降低炎癥反應，實現促進糖尿病足潰瘍愈合的目的，為中醫“扶正祛邪”理論提供了一定的客觀依據。