基于系統藥理學分析野生真菌硬皮馬勃治療腫瘤多層次作用機制＊

李 敏，王宜磊，高 霞，周廣燦，唐 欣，張桂榮，崔 慧

（1. 菏澤學院農業與生物工程學院微生物重點實驗室 菏澤 274015；2. 山東省農業技術推廣中心 濟南 250014）

腫瘤是指人體在各種致瘤因子的作用下局部組織細胞異常增生所形成的新生物。腫瘤已是嚴重威脅全球居民生命和健康的疾病之一，根據國際癌癥研究中心數據表明，2018 年全球新發惡性腫瘤病例約1800 萬，死亡 960 萬例，位居全球死因首位[1]，我國每年腫瘤新發病例約392.9 萬例，死亡233.8 萬例[2]，且惡性腫瘤發病率呈上升趨勢。常規的治療方法為手術、放療和化療等，放療、化療在殺死腫瘤細胞的同時對機體的消化系統和造血系統損傷嚴重，且具有顯著的毒性、耐藥性等不良反應。與其相比，中藥具有對控制病情，提高生存質量，降低放、化療不良反應，降低腫瘤復發等發揮越來越重要的作用[3]。藥用真菌作為中藥的一種，含有多種抑制腫瘤生長的功能成分[4]，在治療腫瘤和疑難雜癥中具有獨特的優勢和潛力。

藥用真菌在我國傳統醫學中具有悠久的使用歷史[5]，東漢《神農本草經》中就有10 余種藥用真菌的記載[6]，但是對藥用真菌的分類、鑒定缺少模式標本材料和方法單一[7]，且同一藥用真菌的形態特征在不同環境和生長階段也不相同，對其研究相對匱乏，導致認知不充分，特別是民間藥用真菌的研究、整理甚是稀少，使其廣泛推廣應用和深度開發受到嚴重限制。因而，開展當地民間藥用資源大型真菌的鑒定、分類、藥效成分分析及其作用機理十分必要。本文對當地民間應用最普遍的野生藥用真菌進行組織分離，獲得菌株M-1，通過形態學和核糖體rRNA 基因內轉錄間隔區（ITS）序列進行鑒定，該菌為硬皮馬勃（Scleroderma sinnamariense）。

硬皮馬勃（Scleroderma sinnamariense）屬于馬勃目，馬勃科，硬皮馬勃屬，該屬分布于世界各地，約60多種，我國較常見的有11種[8]，主要分布于山東、吉林、內蒙古自治區等地。《名醫別錄》記載馬勃“味辛平無毒，主治惡瘡馬疥”[9]，惡瘡即為現代腫瘤[10-12]。最近研究表明，硬皮馬勃活性成分4,4-二甲氧基維甲酸及其衍生物顯著抑制NCI-H187 腫瘤細胞生長[13]，Zhang 在多根硬皮馬勃研究同樣發現甾醇類活性成分能抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細胞介素（IL-6）[14]，而且馬勃狀硬皮馬勃多糖提取物對腫瘤細胞HepG2 和人肺癌A549 細胞具有顯著的抑制作用[15]。但是硬皮馬勃活性成分和作用機制仍不清楚，藥用真菌藥效成分復雜，其作用位點較多且各成分間協同作用體系復雜，采用傳統的方法篩選藥物成分、解釋其作用機理難度極大。然而，中藥系統藥理學（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP）借助于計算機技術在藥物靶點、疾病的發病、治療機制研究、精確調控細胞內復雜網絡和提高藥物的療效等方面提供了新的策略[16]。因此，本文應用系統藥理學理論和技術體系，文獻中硬皮馬勃化學成分，借助TCMSP 數據庫尋找硬皮馬勃有效的、新穎的、潛在的抗腫瘤成分，整合網絡分析、功能富集和通路等技術，探討其抑制腫瘤的潛在作用機制及其規律（圖1），為揭示有效成分的作用機制提供新思路，希冀為腫瘤藥物的開發提供新的視角和理論依據。

圖1 系統藥理學流程圖

1 材料與方法

1.1 供試材料

2018 年6 月，從山東省定陶區仿山草叢里采集一株野生藥用真菌子實體，置于一次性封口袋中，在微生物實驗室進行分離、純化、鑒定和保藏，菌株編號為M-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 M-1菌株純化和鑒定

形態學鑒定：先將采集的子實體用清水清洗干凈，然后用75%乙醇消毒，再用無菌水清洗掉乙醇，在無菌條件下將組織切成小塊接種于PDA 培養基上，置于26℃培養，獲得純化菌株M-1，分別置于4℃和-80℃保藏備用。無菌條件下挑起菌絲接種平板上，接種點2 cm 處插入無菌蓋玻片，待菌絲生長其上后取出置于光學顯微鏡下觀察菌株的形態特征。

分子鑒定：將分離純化的菌絲采用CTAB 法[17]提取菌株DNA，基于核糖體rRNA 基因內轉錄間隔區序列 ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對其 DNA 進行擴增，PCR 反應體系為 50 μL，包括 DNA 模板 2.0 μL，2.5 μmol·L-1的前后引物各 2 μL，2×tag PCR Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR 擴增程序為94℃ 5 min，35 個循環（94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min），72℃ 10 min，PCR 擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余PCR擴增產物純化后送上海生物工程股份有限公司進行測序，測序結果用DNAMAN6.0 和Chromas Pro 軟件進行堿基修正與拼接，利用在線數據庫NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）對拼接后的序列進行同源序列比對，獲取相似序列。

1.2.2 馬勃活性成分庫的構建及靶點預測

從文獻中獲取硬皮馬勃化學成分，利用TCMSP 數據庫檢索其化學成分，并進行后續的系統分析。利用虛擬ADME 系統，計算硬皮馬勃化學成分藥用動力學參數，依據網站推薦閥值，以參數口服生物利用度（Oral Bioavailability OB）＞18% 和 類 藥 性（Drug Likeness DL）＞0.1 為潛在高活性成分進行篩選，利用ChemBio獲得潛在高活性成分的結構式。

在篩選到活性成分的基礎上，利用藥物靶向工具（SysDT）[18]和加權系綜相似度（WES）[19]系統預測獲得活性成分對應作用靶點。首先利用SysDT即兩個數學工具，隨機森林（RF）和支持向量機（SVM））系統對潛在作用靶點打分，選擇參數SVM≥0.8 和RF≥0.7 的靶點作為有效作用靶點，利用WES模型挖掘藥物直接靶點，該模型在預測敏感性和特異性方面表現良好，準確度達到78%。對篩選到的靶點進行整理，利用Gene Cards Suite（https://www.genecard.org）對靶點名稱進行標準化，將標準化靶點映射到CTD（http://ctdbase.org/）數據庫，獲得與腫瘤相關靶點，這些靶點作為硬皮馬勃活性成分的藥理學靶點進行后續的探討。

1.2.3 活性成分—靶點網絡（C-T）的構建及分析

為明確硬皮馬勃潛在活性成分和靶點之間的關系，基于TCMSP 數據庫篩選出的活性成分和靶點導入Cytoscape3.8.0軟件，構建可視化網絡圖（C-T），并進行網絡拓撲參數分析。在C-T 網絡圖中，節點表示硬皮馬勃活性成分和靶點，邊表示活性成分和靶點蛋白之間的相互作用。在C-T 網絡圖中，與節點相關聯的邊的數量為“度值”，根據節點關聯的邊數的多少來評價節點的重要程度，邊數越多，該節點越重要，節點也越大，反之越小，遴選出關鍵活性成分和核心靶點。

1.2.4 靶點的生物功能和通路富集分析

為了揭示活性成分潛在的作用機制，利用在線分析平臺 DAVID（https://david.ncifcrf.gov）和 Metascape（https://metascape.org）對靶點進行GO（Gene Ontology）生物功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。設定閥值p-value ＜0.01，篩選排名靠前的通路，使用柱狀圖對富集結果進行展示，利用在線分析平臺Metascape 構建抗癌靶點蛋白互作網絡，揭示硬皮馬勃潛在活性成分在治療腫瘤中參與的生物學過程和涉及的通路。

1.2.5 靶點-通路（T-P）網絡的構建及通路整合分析

為了探究活性成分作用靶點和通路之間的關系，利用富集分析獲得KEGG 通路，構建靶點-通路（T-P）網絡圖，用Cytoscape3.8.0 軟件對T-P 進行網絡可視化，并利用網絡分析模塊對網絡拓撲參數分析。在TP 網絡中，節點表示活性成分作用靶點和KEGG 通路，邊表示靶點和通路之間的隸屬關系。在T-P 網絡圖中，與節點關聯的邊的數量為“度值”，根據節點相關聯的邊數多少來評價節點的重要程度，邊數越多，該節點越重要，節點也越大，反之越小，篩選出關鍵靶點和主要作用通路。

2 結果與分析

2.1 野生真菌形狀和顯微鑒別

M-1 菌株子實體呈（圖2a）梨形、近球形，菌柄較短，子實體較硬，菌蓋有裂口，外表淺黃色，局部微褐色，內部潔白。無菌條件下將子實體接種于PDA 培養基上，分離純化后的菌落干燥潔白，圓形，邊緣整齊，平板背面無菌絲分泌物呈現（圖2b）。菌絲粗壯，有橫隔，分支較多，頂端略圓（圖2c）。形態學鑒定在本校微生物教研室王宜磊教授的指導幫助下完成。

圖2 M-1菌株鑒別

采用CTAB 法提取菌株DNA，PCR 擴增獲得長度530 bp ITS 序列片段，將擴增片段回收、測序，測定序列為：CATTATCGAAGTCGAACGCTAGGAGGGAGAAGGGGAGCC CGTCGCTCCTCGGACCTCTCCGAAGCTTCAACCTTCTT CACACCCGTGTGCACCCGCTGTAGGTCCTTCGGGATCC TACGTCTTCGCTCTCGAACTCGCATGTCTACAGAATGTC CATGTCGTGTCGACCGGCGTCCGCGTCGGCGACCGCAA ACCTTTGTACAACTTTCAGCAATGGATCTCTTGGCTCTC GCATCGATGAAGGACGCAGCGAATCGCGATAAGTAATGT GAATTGCAGATTTTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACG CACCTTGCGCTCCTCGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGT TTGAGTGTCATCGAAATCTCGAACCGAAGCCTTCGATCC GTTCGAAGCTCGGTCTCGGAACGTGGGGGTCTGCGGGC GGCGACGTCGGCTCCCCTCAAACGCATCAGCTGTGGGC ACGAGCCCTGCGTGGCACGGCCTCCCCGACGTCGTAACGATCGTCGTGGGCTGGAAGCGCAGTGATCGGCGATCCC ATGCTTTCCAACCTTTTTCTCGAAGCT。 在 線 NCBI 數據庫進行核酸序列比對，該序列與硬皮馬勃對應序列同源度100%，結合子實體、菌落和菌絲特征，初步認為該菌株為硬皮馬勃（Scleroderma sinnamariense）。

2.2 硬皮馬勃活性成分庫的構建及ADME 虛擬篩選

從文獻中獲得硬皮馬勃的化學成分59 個，通過TCMSP數據庫查找到的化學成分37個，根據ADME系統虛擬篩選標準，以參數OB%＞18，DL＞0.1 進行篩選，獲得活性成分7 個，分別為脂肪酸、甾體化合物、脂類和醇類，其藥用動力學和結構相關信息在表1 中。其中，活性成分亞油酸（LA）[20]和棕櫚酸（PA）[21]已被報道具有抗腫瘤作用。

表1 硬皮馬勃活性成分及其藥用動力學參數

2.3 硬皮馬勃活性成分靶點預測及C-T 網絡的構建

通過SysDT 和WES 系統獲得7 個活性成分（表1），其中TCMSP 數據庫里僅有5 個潛在活性成分的靶點，共獲得38 個無重復靶點，分別為：PTGS1、PTGS2、RXRA、NCOA2、IGHG1、GABRA1、PGR、CTSD、BCL2、IL10、TNF 等，平均每個潛在活性成分靶點為7.6 個。將38 個靶點映射到CTD 數據庫中，獲得靶點的功能，以Cancer 為關鍵詞篩選與腫瘤相關靶點16 個。將5個活性成分和腫瘤相關16 個靶點導入Cytoscape3.8.0軟件構建硬皮馬勃活性成分和藥理學靶點（C-T）網絡圖（圖3），基于21 個節點（活性成分5 個和靶點16 個）和26條邊構建C-T網絡圖。圖中紅色圓點表示靶點，綠色箭頭表示活性成分，邊表示潛在活性成分對靶點的作用。通過拓撲分析發現，高度值的分子和靶點可能在腫瘤治療過程中發揮重要作用，硬皮馬勃活性成分LA和PA的度值較高，分別為7和11，這些活性成分可能在硬皮馬勃治療腫瘤中發揮重要作用。取前6個靶點為核心靶點，分別為 NCOA2、PTGS1、PTGS2、PGR、IGHG1和RXRA等靶點的拓撲參數相對較高，表明這些靶點可能是活性成分作用的核心靶點。不同活性成分作用在同一個靶點，且同一活性成分作用不同靶點，推測這些活性成分可能存在多靶點、多途徑的協同作用。

圖3 活性成分-靶點網絡

2.4 馬勃靶點的生物功能和通路富集分析

為進一步證實硬皮馬勃活性成分靶點與腫瘤相關性，應用Metascape 工具和DAVID 數據庫對靶點進行生物功能和通路富集分析（圖4）。為了更好的明確活性成分作用靶點過程和位置，對其生物功能分析，分別從生物學過程（biological process, BP）、分子功能（molecular function, MF）和 細 胞 組 分（cellular component, CC）3 個水平對 16 個靶點進行 GO 富集分析，按照P＜0.01 的閾值過濾，共富集到65 條生物功能，選取富集顯著程度靠前的條目進行繪制可視化圖形（圖4a）。富集度較高的生物學過程主要包括：糖皮質激素分泌、一氧化碳合成正向調控、鐵離子對初始轉移的正向調控、藥物反應、細胞對缺氧反應、正調控序列特異性DNA 結合轉錄因子活性、免疫反應、發熱產生的積極調節、細胞因子分泌的負調控參與免疫反應；分子功能包括：prostaglandin-endoperoxide 合酶活性、酶結合、過氧化物酶活性、相同的蛋白結合、細胞外配體門控離子通道活性、類固醇激素受體活性、PDZ結合功能域、特異性DNA結合、鋅離子結合等；細胞組分包括：突觸后膜、質膜的外部、胞外區、胞器膜、細胞外空隙（圖4a）。KEGG 富集通路分析顯示（圖4b），硬皮馬勃活性成分參與的通路有小細胞肺癌信號通路（hsa05222），MAPK 信號通路（hsa04071），NF-kappa B信號通路（hsa04064）等多個信號通路，這些通路參與不同的腫瘤細胞的增殖和遷移，誘導或加速腫瘤細胞的凋亡，活性成分在通路上主要作用的靶點有IL10、PTGS1、PTGS2、TNF、RXRA 和BCL2 等，這些靶點參與免疫應答，腫瘤細胞的增殖、遷移和凋亡等多種生物學過程。

圖4 GO和通路富集分析。

2.5 靶點-通路（T-P）網絡構建及分析

為了進一步揭示硬皮馬勃活性成分作用靶點和通路之間的關系，提取富集分析結果中KEGG 通路及通路相關靶點，利用Cytoscape3.8.0 軟件構建T-P 網絡圖（圖5）。T-P 網絡圖含有25 個節點（9 個靶點和16條通路）和45 條邊。網絡拓撲圖分析表明，網絡的某些通路與多個靶點相關聯，如小細胞肺癌通路（hsa05222）和Toll-like receptor（hsa05152）等通路分別與4 個靶點相關聯，該通路主要參與腫瘤細胞的轉移和增殖。MAPK通路（hsa04071）與4個靶點相關聯，主要參與免疫與腫瘤細胞增殖。NF-Kappa 通路（hsa04064）與3 個靶點相關聯，主要參與腫瘤細胞的凋亡。由此我們推斷硬皮馬勃活性成分整合多信號通路抑制腫瘤細胞轉移和增殖，促進癌細胞凋亡等生物學功能。目標靶點也與多個通路相關聯，如：TNF靶點與11 個通路相關聯，其次BCL2 靶點與8 個通路相關聯，IL10靶點與7個通路相關聯，說明這些靶點是硬皮馬勃活性成分主要作用的靶點。

圖5 T-P網絡圖

2.6 馬勃活性成分治療通路的整合分析

為了深入理解硬皮馬勃治療腫瘤的整體機制，我們整合MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT、NF-Kappa和小肺癌細胞中的PI3K-AKT 等關鍵信號通路，構建了硬皮馬勃治療腫瘤的主要通路圖（圖6），這些通路參與細胞免疫應答，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，促進腫瘤細胞的凋亡等生物學功能。

圖6 目標靶蛋白在精簡癌細胞途徑上的分布

3 討論

根據國際癌癥研究中心數據表明，腫瘤發病率呈上升趨勢，已威脅全球居民生命和健康。常規治療方法容易造成機體損傷和明顯不良反應，而中藥治療對機體安全性相對較高，特別是藥用真菌在一些疑難雜癥和慢性病的治療中顯示其突出優勢。硬皮馬勃為當地民間藥用大型真菌，在治療老年外陰濕疹及痔瘡手術后排便困難，阻止傷口止血、凍瘡流水等疾病方面具有較好的療效。為了更好了解、開發和利用此藥用真菌，對其進行形態學和核糖體rRNA 基因內轉錄間隔區（ITS）方法鑒定，確定為硬皮馬勃（Scleroderma sinnamariense），屬于硬皮馬勃科的一種。

從已有文獻資料中獲知，硬皮馬勃化學成分59個，根據藥用動力學ADME 系統虛擬篩選獲得7 種活性成分，分別為脂肪酸（2種）、甾體化合物（3種）、脂類（1 種）和醇類（1 種）。由于硬皮馬勃活性成分作用機制的相關研究較少，目前僅發現5種活性成分的靶點，其中PA 和LA 作用靶點較多，可能是抑制腫瘤的主要成分。有關機制表明，PA通過調節膜流動性和糖代謝來抑制腫瘤細胞的生長[21]，也可通過抑制腫瘤細胞分泌的外泌體[26]或下調靶點基因IL-10 的表達水平來抑制腫瘤細胞的增殖和轉移[27]。Lei研究發現PA 通過自噬激活和內質網應激誘導Saos-2肉瘤細胞凋亡[28]。而LA 主要通過調節雌激素受體（ERa）、G13a G 蛋白、p38 MAP kinase 基因表達，改善細胞微環境，間接參與腫瘤細胞的凋亡[29-30]。甾體化合物是真菌次生代謝產物，屬于天然抗氧化劑，具有抗炎、抑制腫瘤血管生成的作用[31]，它主要通過上調抑癌基因Foxo3 表達和激活凋亡蛋白Puma 和Bax，有效抑制腫瘤細胞的遷移、增殖，誘導腫瘤細胞凋亡[32-33]。由此可見，這些成分在抑制腫瘤細胞生長、增殖、遷移，誘導其凋亡方面具有重要作用。

通過KEGG 通路分析獲得65 條相關信號通路，整合 PI3K-AKT、MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT、NF-Kappa 等關鍵信號通路及其通路上的靶點蛋白，能夠清晰展示通路、靶點蛋白之間的關聯，更好揭示硬皮馬勃活性成分治療腫瘤的機制。本研究發現，MAPK 、Toll-like receptor 和 NF-Kappa 信號通路參與了免疫應答，除了NF-Kappa通路其余4條通路均參與腫瘤細胞的轉移和增殖，此外Toll-like receptor和Jak-STAT 信號通路還參與了腫瘤細胞的凋亡，表現出多通路，多層次的協同增效作用。

免疫是一個復雜的生物學過程，免疫系統對病原體的抑制，導致炎癥反應和專業吞噬細胞積累到入侵部位[34]。硬皮馬勃活性成分可能通過MAPK、NFKappa 和Toll-like receptor 信號通路（圖6）上的關鍵靶點 IL10、TNFα、BcL2/XL 和 COX2 參與細胞的免疫反應。MAPK、NF-Kappa 和 Toll-like receptor 信號通路參與多種炎癥過程并能促進炎癥的發生[35-36]，下調或抑制這些炎癥通路，可以控制炎癥反應，提高免疫應答[37]。活性成分作用靶點TNFα、BcL2 和 IL10 的通聯度較高（圖5），分別為11、8 和7，說明這些靶點可能是其關鍵靶點。我們推測，硬皮馬勃活性成分可能是通過抑制炎癥提高免疫達到抑制腫瘤增殖和遷移的目的。Hu 沉默 DPP4 基 因和 Zhen 敲除 COL12A1 基因 抑制MAPK 通路，從而抑制細胞增殖和遷移，促進腫瘤細胞凋亡[38-39]，證明該推測正確，表明硬皮馬勃活性成分在炎癥反應和抑制腫瘤發生和發展過程中發揮重要作用。

硬皮馬勃活性成分可能通過PI3K-AKT、MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT信號通路抑制腫瘤細胞的遷移和增殖，調控這些信號通路在腫瘤治療過程中可能具有較好的療效。硬皮馬勃活性成分可能通過調控基因表達或沉默基因，抑制通路[40-41]和趨化因子，間接參與抑制腫瘤細胞轉移和增殖[42]；也可能抑制AKT磷酸化[43]，導致細胞周期蛋白表達的改變[44]，或直接作用于靶點蛋白IFNy，通過Jak-STAT 通路抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，此推測需要實驗進一步證實。總之，不同通路在不同類型的腫瘤中可以被不同分子激活，從而呈現出不同表型。

通過整合通路發現，硬皮馬勃活性成分可能通過Toll-like receptor、Jak-STAT 信號通路，作用于靶點蛋白iNOS，促進腫瘤細胞的凋亡，這與Li 用姜黃素上調miR-99a基因抑制JAK/STAT通路，抑制視網膜母細胞瘤（Rb）增殖，并促進凋亡[45]的研究結果一致。表明JAK/STAT 通路在很多癌癥中被激活，加強了癌細胞的擴散[46-47]，由此可推導抑制該通路可以控制某些腫瘤細胞擴散。

本研究通過GO 功能和KEGG 通路富集分析，進一步揭示硬皮馬勃活性成分作用的16個關鍵靶點，以及它們在基因功能和信號通路中的作用。TNF、IL10、BCL2 和PTGS2 等靶點在細胞膜、細胞質和細胞器部位發生蛋白結合、調控關鍵基因表達、抑制趨化因子和磷酸化等分子反應，進而調控PI3K-AKT、MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT 和 NF-Kappa 等 信 號 通路，抑制腫瘤細胞的生長和侵襲，誘導或促進腫瘤細胞凋亡，充分體現了硬皮馬勃活性成分具有多通路，多靶點、多層次的增效作用。

綜上所述，通過形態學和分子生物學鑒定當地民間藥用野生大型真菌為硬皮馬勃（Scleroderma sinnamariense）。基于中藥系統藥理學、ADME、靶點預測、網絡拓撲圖分析和通路分析等方法，挖掘潛在的活性成分（PA、LA 等）5 種，這些活性成分主要通過Toll-like receptor、PI3K-AKT、MAPK 和 NF-kappa B 等通路作用于關鍵靶點蛋白（TNF、IL10、BCL2 等），參與免疫應答，抑制腫瘤細胞生長、增殖，促進其凋亡，為傳統藥用真菌研究提供方法，腫瘤新藥的開發和臨床應用提供了理論支撐和新思路，但潛在活性物質的分離及其在體外抑制腫瘤的效果還需要進一步驗證。