基于可視化環介導等溫擴增技術快速檢測中藥材蜈蚣真偽＊

胡超逸，鄧 犇，張景景，范蔭蔭，管 瑤，張 凱，劉義飛，胡志剛 ＊＊，森 林＊＊

（1. 湖北中醫藥大學藥學院 武漢 430065；2. 湖北金貴中藥飲片有限公司 武漢 430065）

動物藥是中醫藥體系的重要組成部分，蜈蚣作為一味藥用動物，其干燥全體是臨床常用的傳統動物藥材之一；特別是近些年，大量研究顯示蜈蚣和其毒液在抑制腫瘤、治療銀屑病等方面展示的巨大潛力[1-3]，使得藥用蜈蚣的使用數量逐漸增加。唇足綱在全球共有3000多種蜈蚣，在我國蜈蚣屬亦有十余種蜈蚣分布[4]，但少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilansL.Koch）是《中國藥典》1963 至2020 版所收錄蜈蚣藥材（scolopendra）的唯一基源[5-6]。少棘巨蜈蚣作為一種唇足綱的藥用動物資源，特殊的生活習性和對環境的嚴苛要求，使得在土地利用情況發生變化的環境下，野生資源逐漸減少。同時人工養殖難度較大，這些因素使得蜈蚣資源逐漸衰竭，蜈蚣藥材價格逐年增高。作者在亳州、安國、荷花池、玉林等國內多家主要藥材市場發現[7]：為牟取蜈蚣藥材價格上漲所帶來的利益，多家商鋪銷售有與少棘巨蜈蚣的外觀性狀相似，但體型相對較長的偽品，該類偽品較長的體型恰好符合“長條蜈蚣價格較高”的市場規律和采購者的偏好，進一步研究發現該偽品為同屬物種多棘巨蜈蚣（S.subspinipes multidensNewport）。同時在湖北宜昌、襄陽以及浙江舟山等主要產地發現，多年來一直存在著部分養殖戶堅持人工馴化養殖的嘗試，其中所面臨一個重要問題是農民在選擇種苗時常誤選多棘巨蜈蚣進行飼養。雖然多棘巨蜈蚣與少棘巨蜈蚣藥材外觀性狀較為相似（圖1a，圖1b），但少棘巨蜈蚣是《中國藥典》2020 版收載的唯一基原，且沒有關于兩者在臨床上可以代替使用的報道，因此若能夠有效的對蜈蚣進行快速鑒別，必定能夠從源頭推動其資源的可持續利用和更多臨床價值的挖掘。

蜈蚣作為傳統動物藥材，與植物藥的有效成分研究相對成熟的現狀相比，其有效成分多為大分子，給采用化學手段鑒定帶來了一定困難。而傳統的性狀和顯微鑒定需要多年經驗積累且主觀性較強[8-10]，另外因蜈蚣藥材養殖年限的不同給傳統鑒定方式再次增加了困難[11]。分子鑒定的出現有力的解決了動物樣品因成分、性狀等問題造成的干擾，尤其是陳士林等人提出的中藥材DNA 條形碼技術是一種通用易推廣的中藥材鑒定新技術[12-13]，該技術不受藥用動植物的生長因素、不同的發育階段或樣品器官組織差異的影響[14]，其中所推薦采用的動物COI 條形碼序列對動物藥材的真偽顯示出了非常高的鑒定效率，可以有效區分少棘與多棘巨蜈蚣（圖1c，圖1d 分別為少棘和多棘巨蜈蚣COI序列條形碼），是目前鑒別蜈蚣藥材真偽的重要方法。但為了能夠更加快速地指導市場流通和產地種源鑒定，有必要開發出一套更為快速簡便的鑒定方式，能夠直接應用于蜈蚣藥材的現場鑒定。環介導 等 溫 擴 增 技 術 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種能夠在恒溫條件下進行反應的核酸擴增技術[15]，與常規PCR 擴增反應相比，LAMP 擴增有其難以替代的優勢，如：反應不需要PCR儀等儀器設備，只需一臺能夠提供恒溫環境的水浴鍋等常見加熱裝置；反應時間較快，通常只需幾十分鐘就能夠完成整個反應[16-17]。利用這一優勢，在反應體系中加入羥基萘酚藍（hydroxynaphthol blue, HNB）等指示染料，利用該染料能夠與反應副產物結合變色的特點，在反應過程中和反應結束后，直接通過肉眼判斷反應是否發生[18]。憑借這些優勢LAMP 擴增反應技術已被廣泛引入動、植物、病毒等輕工和醫學領域的快速鑒別[19-22]。

本研究借鑒DNA 條形碼對蜈蚣藥材的鑒別結果和LAMP 擴增技術對其他動物藥材成功鑒別經驗，針對少棘巨蜈蚣的COI序列，設計了其專屬特異性引物，進一步構建其LAMP檢測體系。利用該鑒定體系對其反應時長、最低能夠檢測到的DNA 濃度進行了判斷，同時對混偽品進行檢測，驗證該體系的特異性，并在此基礎上對該方法日后用于現場檢測的可行性和可能存在的問題進行了探討。

1 材料

1.1 實驗材料

在對各主流藥材市場調研過程中，搜集到大量蜈蚣藥材樣本，從中抽取3 批少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilansL. Koch）和 3 批 多 棘 巨 蜈 蚣（Scolopendra subspinipes multidensNewport）干燥體，經湖北中醫藥大學胡志剛教授鑒定，憑證樣品存于湖北中醫藥大學藥學院。并使用DNA 條形碼技術對樣品基原再次驗證（圖1c，圖1d 分別為少棘和多棘巨蜈蚣COI 條形碼），按照中藥材DNA 條形碼標準操作指導原則[23]所推薦的COI 序列對6 份蜈蚣干燥樣品進行檢測，將所獲得的6 條樣品序列在全球藥典基因組數據庫[24]（www.gpgenome.com）中進行比對，樣品信息和DNA條形碼比對結果如表1所示。

表1 蜈蚣藥材樣品信息表及COI序列比對結果

圖1 少棘巨蜈蚣S.subspinipes mutilans及其混偽品多棘巨蜈蚣S.subspinipes multidens性狀圖與COI條形碼

1.2 試劑和儀器

動物組織DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，中國北京）；BstDNA 聚合酶、MgCl2、dNTPs、羥基萘酚藍（HNB）指示劑均購自哈爾濱新海基因生物科技有限公司；DNA Marker DL2000（北京擎科生物公司）；引物由上海生工生物有限公司合成。

電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司），瓊脂糖凝膠電泳儀（北京市六一儀器），聚合酶鏈式反應儀（基因有限公司），凝膠成像儀（JS-680B，Peiqing Science & technology） ，NanoDrop 2000（Thermo Scientific Co.,美國）。

2 實驗方法

2.1 DNA提取和稀釋定量

取表1中蜈蚣藥材和混偽品的足部等干燥體組織各約30 mg，使用天根動物DNA提取試劑盒，按說明書要求提取樣品DNA，經NanoDrop 檢測DNA 濃度，作模板DNA儲存使用；利用無菌水對少棘巨蜈蚣模板DNA以10倍梯度進行稀釋定量，冷藏于-20℃備用。

2.2 引物設計

得到少棘巨蜈蚣總DNA 后，使用通用引物對兩種蜈蚣COI系列進行擴增，經測序、生物信息學分析比較其差異信息，通過LAMP Designer V1.15軟件設計并篩選了一套特異性檢測引物組，引物序列特征見表2。

表2 少棘巨蜈蚣COI基因的LAMP引物

2.3 LAMP反應體系

LAMP 反應體系25 μL：包括DNA 模板1.5 μL，Bst DNA 聚合酶10 U、上游內引物FIP 1.6 μM、下游內引物BIP 1.6 μM、上游外引物F3 0.2 μM、下游外引物B3 0.2 μM、環引物LoopF 0.4 μM、環引物LoopB 0.4 μM、100 mM MgCl21.5 μL、10 mM dNTPs 3.5 μL 和羥基萘酚藍指示劑0.15 mM，余量為dd H2O。

2.4 少棘巨蜈蚣藥材特異性檢測

為了檢測LAMP 引物對蜈蚣藥材鑒定的特異性，分別在最佳反應條件下對6 份樣品構建LAMP 反應體系，若反應結果為陽性，反應體系將由紫羅蘭色變為天藍色。同時采用電泳方式對反應結果進行驗證，陽性反應體系的電泳結果呈現典型的梯子形條帶，以此可直接觀察擴增是否發生完成。

3 實驗結果

3.1 LAMP反應條件

按照2.3 要求，平行制備多個含有少棘巨蜈蚣模板DNA 的反應體系，在65℃恒溫水浴鍋中加熱，依次間隔15 min 觀察其顏色變化。如圖2 所示，與起始顏色相比，反應發生15 min 后，含有少棘巨蜈蚣DNA 模板的反應體系由0 min 的紫羅蘭色發生了非常微弱的顏色變化，電泳檢測結果顯示了微弱的梯子形條帶，但尚不能較好的判斷反應結果；繼續加熱15 min 后，可見反應體系已由紫羅蘭色變為天藍色，電泳結果顯示條帶清晰呈梯子形。繼續加熱，至45 和60 min 時，體系顏色仍為天藍色，電泳條帶清晰，說明30 min 的反應時長，足以產生穩定的結果用于判斷反應是否發生。

圖2 60℃恒溫條件下LAMP反應結果

3.2 反應靈敏度

圖3 少棘巨蜈蚣DNA模板依次稀釋后反應結果。

將少棘巨蜈蚣 DNA 模板按照 1、10-1、10-2、10-3、10-4倍數依次進行梯度稀釋，經NanoDrop 測得起始DNA 模板濃度為59.84 ng·μL-1，觀察不同濃度 DNA 在相同反應體系下的差異。30 min后，稀釋至10-3或10-4倍的反應體系顏色仍存在一定變化，電泳結果可以看到較為微弱的條帶，此時DNA 模板濃度為5.984 pg·μL-1，說明在保證30 min的快速反應條件下，仍可確保該方法對低濃度少棘巨蜈蚣DNA的檢測。

3.3 蜈蚣藥材及其混偽品的檢測

分別對1.1 中篩選的6 個批次的蜈蚣DNA 進行LAMP擴增反應，以dd H2O為陰性對照，在60℃恒溫水域條件下使其反應30 min。反應結束后，如圖4 中顯示，含有少棘巨蜈蚣DNA 的三個反應體系（SJ-1，SJ-2，SJ-3）變為藍色，而含有多棘巨蜈蚣DNA 的體系（DJ-1，DJ-2，DJ-3）與陰性對照一致，保持紫色不變；電泳結果顯示少棘巨蜈蚣的擴增體系存在梯子形條帶，而多棘巨蜈蚣無明顯變化。顯示了該引物對少棘巨蜈蚣具有較強的特異性，能夠快速將少棘巨蜈蚣藥材所含DNA與其偽品多棘巨蜈蚣進行區分。

圖4 少棘巨蜈蚣及其混偽品LAMP反應結果

4 討論

前期市場和產地調研發現，多地存在將多棘巨蜈蚣混作少棘巨蜈蚣高價出售的情況，出現這一現象的主要原因在于少棘巨蜈蚣資源縮減、多棘巨蜈蚣與其外觀相似、且蜈蚣藥材價格與體長相關。因此在推進蜈蚣資源可持續利用的過程中，一種快速有效的鑒別方式，是保證人工養殖正確引種和市場健康流通的基礎。在DNA 條形碼等分子鑒定手段應用于蜈蚣藥材檢測之前，主要鑒別方式依賴于性狀鑒別，少棘與多棘巨蜈蚣的性狀差異主要體現在[25]：前者體長多在150 mm 以內，頭板和第一背板為桔紅色，其余背板為墨綠色；而后者體長可達200 mm，頭板和第一背板為紅褐色，其余背板為棕褐色（圖1a、圖1b）。但人工養殖條件下食物充足等因素使部分3齡以上少棘巨蜈蚣體長達到150 mm 以上，且顏色判斷主觀性較強，給蜈蚣的性狀鑒別增加了一定難度[26]。同時蜈蚣作為動物藥材，在干燥、保存過程中，其蛋白成分存在不同程度的酶解情況，給SDS-PAGE 等蛋白鑒定方式也造成了一定的干擾[6]。分子鑒定無疑在蜈蚣等動物藥材鑒定過程中體現了巨大優勢，除DNA條形碼通用鑒別方式以外[27]，先后有多項關于蜈蚣基源鑒別的特異性PCR研究[28-30]，雖特異性引物存在差異，但所用目的片段多為線粒體DNA 上的COI 序列，體現了COI 序列在蜈蚣分子鑒定上的高效性。在此基礎上，本研究設計了一套用于檢測少棘巨蜈蚣的LAMP 引物，與普通PCR 一對引物相比，LAMP 引物包含了一對外引物（F3、B3）,一對內引物（FIP，BIP）和一對環引物（LoopF、LoopB），在以往大量研究中[31-33]證實了LAMP 引物更高的特異性和擴增效率。參照其他物種LAMP 反應體系設計[34-35]和蜈蚣藥材自身特點，本研究進一步設計了一套包含模板 DNA、引物組、HNB 顯色劑、BstDNA 聚合酶以及反應所需的堿基、緩沖液等少棘巨蜈蚣LAMP檢測體系，并證實了該體系能夠在30 min、65℃恒溫條件下對低至皮克級別的少棘巨蜈蚣DNA 模板進行檢測的能力。同時與DNA 條形碼標準操作和其他特異性PCR 相比，該反應體系省去了測序、數據分析過程，因為加入了羥基萘酚藍（HNB）顯色劑，該顯色劑可直接與擴增反應的副產物焦磷酸根離子結合產生顏色變化[36]，因此可通過肉眼觀察結果直接判斷藥材真偽，且反應時間較短，無需PCR 儀等儀器設備，能夠更加快速的指導現場檢測。

隨著LAMP反應的優勢體現，多年來，已有多種藥用動植物LAMP 鑒別研究案例，如Qing Huang[37]等將LAMP 擴增反應用于藥用動物廣地龍的鑒別，Meng Shiou Lee[38]等將LAMP 技術應用于燕窩及其制品的檢測，Ming Li[39]等開發的針對藥用植物的白花蛇舌草的LAMP 鑒別方法。都體現了LAMP 檢測方法在藥用動植物快速鑒別的優勢和可行性，該研究對于少棘巨蜈蚣的快速檢測同樣對于今后其他藥用動植物的快速檢測具有參考意義。而在中藥材LAMP檢測體系構建過程中，關鍵之處在于目標片段的篩選和特異性引物設計，本研究所采用的COI 序列在少棘巨蜈蚣種間保守性較好，在前期的蜈蚣DNA 條形碼研究一文中顯示，多批次少棘巨蜈蚣樣本的COI 序列之間不存在種內變異位點[27]；而與同屬多棘蜈蚣之間存在大量變異區域（圖1c、圖1d），符合LAMP 引物設計要求。結果顯示了該引物組對少棘巨蜈蚣的高特異性，能夠成功的將現今市場上存在的偽品多棘巨蜈蚣進行區分。以往研究顯示，LAMP 技術因反應靈敏度高，容易形成氣溶膠污染，因此可能會出現假陽性的情況[40]。同時，本研究在實驗過程中發現，蜈蚣作為肉食性動物，為避免腹中食物造成干擾，在取樣時，盡量選擇頭部、足部等部位，同時盡量將DNA 提取和試劑配制分開操作。較高的靈敏度對于今后在藥材市場現場推廣蜈蚣藥材的LAMP檢測造成了一定的干擾。為克服這些問題，可在反應管中加入低熔點的固體石蠟來阻止污染[41]。同時，在DNA 條形碼等常規PCR 實驗過程中發現，蜈蚣藥材具有較厚的保護組織，給DNA 提取增加了一定難度，在提取過程中往往需要延長水浴時間以確保足夠的DNA 能夠釋放。但在LAMP 反應過程中，可以檢測到低濃度的少棘巨蜈蚣DNA，在減少測序、數據處理所耗時間的同時，也能夠縮短DNA提取過程中所需要的時間。

該研究基于多地調研現狀，為解決多棘巨蜈蚣混入少棘巨蜈蚣并以較高價格銷售的現狀，將LAMP 檢測技術引入少棘巨蜈蚣真偽鑒定，結合下一步的試劑盒開發和轉化應用，期望能夠實現在得到樣品DNA后，能在短時間內實現樣品的準確鑒別，將對于當下蜈蚣藥材的引種養殖和市場流通所出現的偽品流通情況進行有力監測。另外多年來，墨江蜈蚣、黑頭蜈蚣等其他蜈蚣屬物種的活體和藥材流通區域都極其有限，其資源相對縮減，未曾在各主流藥材市場發現其藥材商品，但近年存在有進口蜈蚣流入藥材市場報道[42]，今后將基于本研究所設計的檢測體系，進一步搜集進口蜈蚣樣品，擴大完善該檢測體系的適用性。