江香薷籽揮發油成分和脂肪酸分析及其抗氧化活性研究

羅 琪，鄧澤元，洪 滔，郭紹勇，陳雨然，羅黎明，馬秋婷，徐 磊，劉志勇*

(1. 江西中醫藥大學，330004，南昌；2. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，330036，南昌；3. 江西金貝農業科技發展有限公司，338000，江西，新余)

0 引言

江香薷(Mosla chinensis Jiangxiangru)作為江西道地藥材，收載于2010版《中國藥典》，該藥材道地產區主要為新余市渝水區、分宜縣等，其為藥食兩用的草本植物，性辛、微溫，有發汗解表、和中利濕之功效[1]。據目前研究，香薷對人體具有重要保健功能和藥用功能，極具開發價值[2]，香薷籽油含有多種脂肪酸和大量的不飽和脂肪酸，其中ɑ-亞麻酸含量為50%～60%，ɑ-亞麻酸為構成人體組織細胞的主要成分，對人體的健康有重要的意義，但在人體內不能合成，必須從體外攝取[3]。香薷籽油可作為高營養價值的食用保健油，對抗癌、大腦發育、提高智力和記憶力具有重要作用。但是目前香薷籽類產品較為少見，其并沒有得到合理的開發和利用。

近年來，對江香薷枝、葉中揮發油以及香薷籽脂肪酸的成分分析及藥用價值研究較多[3-5]，而到目前為止，對江香薷籽揮發油組成及脂肪酸組成分析研究報道較少，還未見江香薷籽脂肪油抗氧化活性的研究報導。因此，本文以江香薷籽為研究對象，采用水蒸氣蒸餾法提取江香薷籽中的揮發性成分，通過GC-MS聯用技術[6-8]對江香薷籽揮發油化學成分進行分離鑒定；采用有機溶劑浸提法提取江香薷籽脂肪油，利用氣相色譜分析江香薷籽脂類組成，并用面積歸一化法測定其百分含量；進一步通過測定二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力和總抗氧化能力來綜合考察江香薷籽油的抗氧化活性，以期為江香薷這一江西道地藥材的質量鑒定、開發利用、藥理作用及臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器與設備 Agilent GC/Q-TOF 7250型氣相色譜-質譜聯用儀(NYSE: A)；色譜柱為DB-Wax(15 m×250 μm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱；普通玻璃水蒸氣蒸餾裝置；SXKW數顯控溫電熱套(北京市永光明醫療儀器有限公司)；電子天平HZQ-A10(福州華志科學儀器有限公司)；CO2細胞培養箱(德國Binde公司)；高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；恒溫水浴鍋(上海博訊實業有限公司)；3001多功能全波長酶標儀(Thermo公司)；96 孔細胞培養板(Corning 公司)；illi-Q-Zntegral 10型超純水機(廈門精藝興業科技有限公司)；6890N型氣相色譜(gas chromatograph，GC)儀(美國Agilent公司)；色譜柱為CP-Sil88(100 m×0.25 mm，Chrompack，Bridgewater，NJ)熔融石英毛細管柱；多功能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司)；0ZF-6050型真空干燥箱(上海新苗醫療器械制造有限公司)；超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.1.2 材料與試劑 江香薷：于2021年采自江西省新余市分宜縣金貝農業科技發展有限公司中藥材種植基地。正己烷、三氟化硼BF3(溶劑為體積分數14%甲醇)、甲苯(西隴科學股份有限公司)；無水乙醚(天津大茂化學試劑廠)；人乳腺癌 MCF-7細胞系(武漢富衡生物有限公司)；磷酸緩沖溶液、0.25%胰蛋白酶、DMEM高糖培養基(北京索萊寶公司)；胎牛血清(Serana)；總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS)(碧云天)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶公司)；DPPH試劑(上海源葉生物科技有限公司)；無水乙醇、二甲基亞砜均為分析純；水為純化水。

1.2 實驗方法

1.2.1 江香薷揮發油的提取 將采收回的帶籽江香薷陰干后，揉搓其果穗，收集搓落下的江香薷籽，除凈莖葉，備用。準確稱取江香薷籽80 g，置于研缽中研碎，置于揮發油提取器中，按照《中國藥典》2010版附錄提取并收集淡黃色油狀液體，用無水硫酸鈉干燥，裝于離心管中密封低溫保存備用。取揮發油用正己烷稀釋500倍后，各取等量10 μL于溶劑瓶中用于GC-MS分析。

提取率(%)= 揮發油體積(mL)/江香薷籽重量(g)× 100 %。

1.2.2 GC-MS檢測條件 氣相色譜條件：色譜柱為DB-Wax(15 m×250 μm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱，柱溫初始溫度60 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升溫至190 ℃，維持6 min，再以5 ℃/min將溫度升至250 ℃，維持5 min。氦氣為載氣，柱流量為1.0 mL/min，進樣口溫度為250 ℃。分流進樣，分流比為40:1，進樣量為0.2 μL。

質譜條件：離子源為EI源，電子轟擊能量為70 eV，倍增電壓為1.765 kV，離子源溫度為230 ℃，質量掃描范圍m/z：50～550 。

1.2.3 江香薷籽油的提取 江香薷籽經干燥、粉碎后，加入無水乙醚(料液比1:8)，60 ℃下回流提取6 h，抽濾得浸提液，液相靜置分層，分離油相，經減壓蒸餾回收溶劑，真空干燥即可，得江香薷籽油粗品。

1.2.4 江香薷籽油脂肪酸化學組分測定

1)甲酯化[9]：精密量取2 mg江香薷籽油于試管(10 mL)中，隨后于試管中加入2 mL BF3和1 mL甲苯，短暫使用氮氣風吹，放入水浴鍋水浴(90 ℃)1 h，冷卻至室溫，于試管中加入3 mL正己烷以及1 mL蒸餾水，渦旋混勻，渦旋后離心(2 000 r/min)10 min。離心分層后用無水Na2SO4柱將上層溶液干燥，再次使用氮氣吹至風干，再次加入1.0 mL正己烷，最后透過濾膜(0.45 μm)過濾。

2)GC條件：色譜柱為CP-Sil88(100 m×0.25 mm，Chrompack，Bridgewater，NJ)熔融石英毛細管柱；進樣口溫度為250 ℃，壓力為24.52 psi，總流速為29.4 mL/min。燃氣為氫氣和空氣，氮氣為助燃氣，流速分別為30 mL/min、300 mL/min和30 mL/min。恒壓不分流，取1 μL進樣；升溫程序：起始溫度45 ℃，維持4 min；將溫度升至175 ℃(13 ℃/min)并維持27 min；升溫至215 ℃(4 ℃/min)并維持35 min。脂肪酸的百分含量用面積歸一化的方法確定(用峰值面積的百分比表示)。

1.2.5 總抗氧化能力測定 取對數生長期人乳腺癌 MCF-7細胞消化接種于6孔細胞培養板中，培養24 h后，精密稱定江香薷籽油適量，配制成不同濃度溶液(200 mg/mL、250 mg/mL、300 mg/mL、350 mg/mL、400 mg/mL、450 mg/mL)，試驗組分別加入江香薷籽油(200 mg/mL、250 mg/mL、300 mg/mL、350 mg/mL、400 mg/mL、450 mg/mL)2 mL于37 ℃和CO2培養箱繼續培養24 h后，收集約100萬個細胞，分別加入200 μL pbs溶液，于超聲粉碎機中破碎細胞，后于4 ℃離心機中離心(12 000 g)5 min，取上清。

1)蛋白測定。按照BCA試劑盒說明書操作。BCA試液與Cu試劑按50：1的比例配制成工作液，取10 μL BSA標準品用PBS稀釋至100 μL，使終濃度為0.5 mg/mL。將標準品按0 μL、 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL加入96孔板中，再分別加入PBS(20 μL、18 μL、16 μL、14 μL、12 μL、8 μL、4 μL、0 μL)。將10 μL樣品和10 μL pbs加入96孔板的樣品孔中。各孔分別加入BCA工作液，37 °C反應15—30 min。通過酶標儀測定A562, 通過標準曲線計算出各樣品蛋白濃度。

按照總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS)說明書操作，將過氧化物酶工作液(20 μL)加入每個檢測孔(96孔板)，空白對照孔中加入蒸餾水(10 μL)；標準曲線孔內加入10 μL各種濃度的Trolox標準溶液(0.15 mM、0.3 mM、0.6 mM、0.9 mM、1.2 mM和1.5 mM)；各種樣品(10 μL)加入樣品孔內，輕晃混勻。ABTS工作液(170 μL)加入每個孔內，混勻。室溫下反應6 min，于414 nm波長下測定吸光度A414。根據標準曲線方程，計算待測樣品的總抗氧化能力值。

1.2.6 DPPH自由基清除能力測定 將DPPH用無水乙醇配制成0.05 mg/mL的溶液，放置4 ℃冰箱并避光保存。用無水乙醇配制成不同質量濃度的江香薷籽油溶液(10 mg/mL、6 mg/mL、 4 mg/mL、2 mg/mL、0.5 mg/mL和0.125 mg/mL)。將不同濃度的樣品和0.05 mg/mL的DPPH溶液各100 μL依次加入96孔板中，輕晃混勻，在室溫下避光孵育30 min，通過酶標儀測定吸光度A517 OD1，同樣測定樣品溶液與無水乙醇各100 μL混合液吸光度A517 OD2，再測定DPPH溶液與無水乙醇各100 μL混合液在A517 OD3，清除率按下式計算，并以維生素c為陽性對照，平行測定3次。

清除率%= [ 1- ( OD1-OD2) /OD3]×100%。

2 結果與分析

2.1 江香薷籽揮發油提取率

實驗結果發現江香薷籽揮發油提取得率分別為0.63%。

2.2 江香薷籽揮發油GC-MS分析

在上述色譜與質譜條件下進行GC-MS分析，得到江香薷籽揮發油的總離子流色譜圖, 如圖1所示。

圖1 江香薷籽揮發油 GC-MS 總離子流示意圖

江香薷籽揮發油的各化學成分及其相對百分含量等如表1所示。

表1 江香薷籽揮發油化學成分GC-MS分析結果

表1 (續)

從表1可知，江香薷籽揮發油成分主要鑒定出31種揮發性成分，其中占比最高的是1，3-二甲基-4-乙基苯(6.49%)，其次為2，3，5，6-四甲基苯酚(6.44%)和(+)-檸檬烯(6.09%)。由表2可知，揮發油成分主要分為萜類(8種)、烯烴類(2種)、酮類(1種)、酚類(4種)、酯類(2種)、烷烴類(6種)、醇類(6種)、芳香類(2種)。其中萜類化合物種類(8種)及相對含量(13.95%)最多，其次酚類(13.54%)和醇類(9.39%)占比最高，醇類(6種)和烷烴類(6種)種類最多。

表2 江香薷籽揮發油種類及相對含量

2.3 江香薷籽油脂肪酸組分分析

江香薷籽脂肪酸的氣相色譜圖見圖2。根據標準圖譜的保留時間及峰面積大小，可鑒別出脂肪酸種類及江香薷籽中各脂肪酸百分含量，見表3。

圖2 江香薷籽油脂肪酸的GC圖譜

表3 江香薷籽油的脂肪酸組成

由表3可知，江香薷籽油經GC分析后共鑒定出7種化學物質，其中大部分屬不飽和脂肪酸，含量較高的有18:3n-3(α-亞麻酸)(67.34%)、9C12C18:2(亞油酸)(12.97%)、9C18:1(油酸)(9.18%)、16:0(棕櫚酸)(7.22%)等。江香薷籽油中不飽和脂肪酸含量較高，且其中α-亞麻酸高達67%，目前自然界中，人類所發現含有α-亞麻酸最高的食用油是紫蘇籽油(67%)。故江香薷籽油具有很高的營養價值，可作為一種新型的功能油脂，具有極高的食用價值。

2.4 江香薷籽油總抗氧化能力

ABTS法測定總抗氧化能力的原理見圖3。在一定的氧化劑作用下ABTS可被氧化成ABTS·+，而在抗氧化劑存在時ABTS·+生成減少，測定吸光度A414或A734即可計算出各樣品的總抗氧化能力。

由BSA蛋白標準品標準曲線可知，其在0～0.5 mg/mL之間線性關系良好，回歸方程為Y=0.841X+0.194 2(r=0.995 7)，根據標準曲線計算出蛋白濃度；由Trolox標準品標準曲線可知，其在0.15～1.5 mM之間線性關系良好，回歸方程為Y=1.172 5X+ 0.003 3(r=0.999)，根據標準曲線公式即得出該樣品的抗氧化能力為0.5 mmol/g，同時測得維生素c的抗氧化能力為1.024 mmol/g，結果表明江香薷籽油具有一定的抗氧化能力，但與維生素c相比，抗氧化能力存在一定差距。

2.5 江香薷籽油DPPH 自由基的清除能力

由圖4可知，在實驗范圍內，江香薷籽油濃度與江香薷籽油DPPH的清除能力存在正相關關系。隨著江香薷籽油濃度的增加，DPPH清除能力隨之增強，當江香薷籽油濃度為10 mg/mL時，其DPPH清除率達到58.168%(表4)。也就證實江香薷籽油擁有一定的清除DPPH自由基的能力，但與Vc比較清除力依然較弱。

表4 江香薷籽油DPPH 自由基的清除能力

圖4 江香薷籽油DPPH 自由基的清除能力

3 討論與結論

本試驗中，利用GC-MS等方法對江西省新余市分宜縣江香薷籽揮發油及脂肪酸進行了化學成分分析及體外抗氧化活性試驗，結論如下。

1)江香薷籽揮發油主要的化學成分是1，3-二甲基-4-乙基苯、2，3，5，6-四甲基苯酚和(+)-檸檬烯，且揮發油成分主要分為烯烴類、醇類、酮類、酯類、酚類、萜類、烷烴類和芳香類，其中萜類化合物占比及種類最高，而很多萜類化合物具有重要的生理活性，是研究天然產物以及開發新藥的重要來源。

2)不飽和脂肪酸是人體不能合成而又必需的脂肪酸，具有調節血脂、清理血栓、免疫調節、維護視網膜、提高視力、補腦健腦、改善關節炎癥狀減輕疼痛等多種重要生理功能；α-亞麻酸是人體必須的營養素之一，對人體的健康有重要的意義，具有增強智力、提高記憶力、保護視力、改善睡眠、抑制血栓性疾病、預防心肌梗死和腦梗死、降低血脂、降血壓等功能[10-13]。氣相色譜分析表明江香薷籽油中不飽和脂肪酸含量高，其中亞麻酸含量高達67.34%。而目前自然界中，人類所發現含有α-亞麻酸最高的食用油是紫蘇籽油(67%)，表明江香薷籽油可作為優質食用油，極具有開發價值和市場前景。

3)通過DPPH和ABTS常用兩種體外抗氧化試驗，研究結果表明，江香薷籽油存在一定的體外抗氧化性能，可嘗試作為天然的抗氧化劑使用。

綜上所述，江香薷籽具有一定的藥用價值和較高的營養價值，可在醫療、保健等領域進行更深入的研究與挖掘，其油脂可作為油脂新資源進行深度開發，望本研究數據對于該植物開發利用提供科學依據，同時對藥食兩用植物資源的開發、利用和保護起一定指導作用。

致謝：感謝江西中醫藥大學藥學院嚴志宏老師、向汝群碩士在成分檢測分析上提供的幫助！