甘藍黑腐病田間病害分級標準的建立與抗源篩選

陳 果 孔樅樅 馬洪雪 鄧四平 季家磊， 王 勇， 莊 木， 張揚勇， 楊麗梅， 關慧明 方智遠， 呂紅豪，*

（1 中國農業科學院蔬菜花卉研究所，農業農村部園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京 100081；2 湖南農業大學園藝學院，園藝作物種質創新與新品種選育教育部工程研究中心，蔬菜生物學湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；3 烏蘭察布冷涼蔬菜院士工作站，內蒙古烏蘭察布 012000）

結球甘藍（L.var.L.）簡稱甘藍，是一種重要的蕓薹屬蔬菜作物，在我國各地廣泛種植（方智遠，2008）。由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種（pv.，）引起的黑腐病屬于細菌性病害，是目前危害甘藍及其他蕓薹屬蔬菜生產的主要病害之一。

甘藍黑腐病最早發生于美國（Garman，1892），隨后逐漸蔓延至世界各地，尤其是對亞洲、歐洲和北美的甘藍類作物生產造成了重大危害（Williams，1980；Jensen et al.，2010；Singh et al.，2016）。我國黑腐病最早發生于20 世紀50 年代末的華北地區（樊護民，1989），80 年代普遍流行于全國各地。近年來，由于不合理的耕作方式以及頻發的極端天氣等因素，黑腐病對我國蕓薹屬蔬菜作物的危害逐漸加重，嚴重時可減產70%以上（張揚 等，2011）。在黑腐病防治方面，傳統的農業、化學方法耗時、耗力且效果有限，目前最理想的減輕黑腐病發生的方法是培育和應用抗病品種。

挖掘和篩選抗源材料是開展抗黑腐病育種工作的基礎。自20 世紀50 年代以來，國內外學者不斷開展甘藍抗源篩選工作。例如，Bain（1952）采用種子浸染法篩選出2 個抗黑腐病甘藍品種Early Fuji和Hugenot；劉佳等（1988）采用剪葉法篩選出2份高抗黑腐病的甘藍材料8286-1 和20-2-5-2；簡元才和釘貫靖久（1994）采用離體剪葉法篩選出3份對黑腐病表現出一定抗性的甘藍材料91-306、91-304 和91-316；Griesbach 等（2003）采用黑腐病生理小種混合接種法篩選出高抗黑腐病甘藍材料AU4518；張恩慧等（2005）對815 份甘藍自交系進行抗性鑒定，獲得4 份抗黑腐病、兼抗蕪菁花葉病毒病和黃瓜花葉病毒病的材料；Lema 等（2012）對256 份甘藍類蔬菜材料進行黑腐病抗性鑒定，發現甘藍材料Balón、Quintal de Alsacia 和芥藍材料MBG-BRS0070 表現出一定的抗性；張云霞（2014）采用室內苗期人工接種的方法篩選出對黑腐病具有穩定抗性的甘藍材料C7；孔樅樅等（2018）鑒定了99 份甘藍材料的黑腐病抗性，篩選出2 份高抗材料99-192 和20-2-5。以上研究結果表明，國內外育種工作者在甘藍黑腐病抗源篩選上取得了一定進展，但甘藍類蔬菜黑腐病抗源依然匱乏，限制了抗病育種工作的開展。

為了更好地推進抗黑腐病甘藍育種工作，一方面需要不斷挖掘和篩選抗黑腐病種質資源，另一方面需建立與抗病育種工作配套的高效、準確的鑒定方法及評價標準。目前，國內尚無統一的田間黑腐病抗性分級標準，因此，梳理和建立一套關于評價甘藍黑腐病田間發病情況及抗性水平的標準尤為重要。

本試驗通過對種植在內蒙古烏蘭察布市的55份甘藍材料進行田間黑腐病鑒定和篩選，建立了一套結球期甘藍田間黑腐病病害分級標準；同時對部分甘藍材料進行室內苗期人工接種抗病性鑒定，驗證擬定的黑腐病田間病害分級標準，旨在為甘藍抗黑腐病育種工作的開展提供抗性種質資源，進而為抗黑腐病甘藍品種的選育以及蕓薹屬蔬菜黑腐病的科學合理防治提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試55 份甘藍種質均由中國農業科學院蔬菜花卉研究所甘藍青花菜課題組提供，包括26 份自交系（自交6 代以上的純合材料）、19 份雜交組合和10 份商品種（表1）；其中，抗病對照為自交系21-3，感病對照為自交系BJ（孔樅樅，2019）。室內苗期人工接種抗病性鑒定使用的黑腐病菌菌株由英國華威大學Joana Vicente 教授提供，菌株編號HRIW3811，屬于主流1 號生理小種，保存于完全培養基（complete medium，CM）中；培養基配方為：酵母提取物6 g·L，酶水解酪蛋白3 g·L，酸水解酪蛋白3 g·L，蔗糖10 g·L，瓊脂15 g·L。

表1 參試55 份甘藍材料的來源及品種特征特性

續表

1.2 試驗方法

1.2.1 甘藍黑腐病田間抗性鑒定 所有參試材料均種植于內蒙古烏蘭察布市集寧區冷涼蔬菜院士工作站試驗基地，2020 年和2021 年5 月播種育苗，待幼苗長至5～6 片葉時移入黑腐病病圃田，8 月對結球期甘藍進行田間發病情況調查。調查內容包括發病甘藍外葉上病斑的大小、數量、深度、寬度、壞死程度以及是否蔓延至球葉，綜合評估發病情況。每份材料3 次重復，每重復10 株，病情指數取兩年調查結果的平均值。

1.2.2 甘藍黑腐病室內苗期人工接種抗病性鑒定 2021 年9 月在中國農業科學院蔬菜花卉研究所南區試驗基地溫室內進行，采用苗期噴霧法對23份甘藍材料（包括13 份自交系、8 份雜交組合和2份商品種）進行接種，病情分級標準和抗性水平的劃分參考孔樅樅等（2018）的方法；另外，有5 份自交系的人工接種鑒定結果采用孔樅樅等（2018）和Kong 等（2021）的鑒定結果。

育苗、接種過程：將參試甘藍材料種子播于21 孔穴盤（62 mm × 62 mm × 65 mm）中，每份材料播種1 盤，每孔播種1 粒；溫室內常規育苗，幼苗4～6 片真葉時，選擇生長健壯、長勢一致的幼苗進行接種。先將黑腐病菌菌株HRIW3811 轉接至液體CM 培養基，在28 ℃、200 r·min的條件下過夜培養至菌株對數生長期；用無菌水調節菌液濃度至1 × 10CFU·mL（OD=0.2）。接種前1 d甘藍幼苗充分澆水并覆膜低溫保濕24 h（溫度低于15 ℃，濕度大于70%）；接種當天早上使用噴霧器將菌液均勻噴灑到全部葉片上，以葉片無液滴滴落為度，接種后溫度升至25 ℃并持續覆膜保濕24 h；然后去除薄膜，于25 ℃條件下常規管理，12～14 d 后調查黑腐病發病情況，計算病情指數。

病情指數（DI）=Σ（各級病株數×該病級值）/（調查總株數×最高級值）× 100

1.3 數據處理

試驗數據采用Microsoft Off ice 2019 軟件進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 甘藍結球期黑腐病田間發病癥狀

黑腐病主要危害甘藍葉片，幼苗和成株期均可發病。在甘藍結球期，黑腐病菌主要從外葉葉緣侵入，首先造成葉緣多處泛黃，形成黃色或黃褐色大斑；之后病菌進一步沿維管束擴展到葉柄，形成較大的“V”字形壞死區并造成葉片干腐或脫落（圖1）；嚴重時可造成球葉干枯壞死，甚至整株萎蔫、死亡。黑腐病發生的嚴重程度與環境濕度關聯很大，靠近潮濕地面或者略有積水地方的外葉發病較嚴重，而中、上層外葉幾乎沒有或者僅有較少病斑。

圖1 甘藍黑腐病田間發病癥狀

2.2 甘藍結球期黑腐病田間病害分級標準的制定

依據甘藍結球期黑腐病田間發病情況制定0、1、3、5、7、9 級病情分級標準，具體要求見表2和圖2。

圖2 甘藍結球期黑腐病田間病情分級標準

表2 甘藍結球期黑腐病田間病情分級標準

隨后基于田間調查結果計算甘藍結球期黑腐病病情指數（DI），進而劃分材料抗性水平：免疫（I），DI=0；高抗（HR），0 ＜DI ≤ 10；抗病（R），10 ＜DI ≤ 30；中抗（MR），30 ＜DI ≤ 50；感病（S），50 ＜DI ≤ 70；高感（HS），DI ＞ 70。

2.3 甘藍黑腐病田間抗病性鑒定結果

從表3 可以看出，參試26 份甘藍自交系中，05-574 和20-2-5 表現高抗，病情指數分別為8.52和8.89；MD202 表現抗病，病情指數為16.30；21-3、721、YF 旺旺、多抗福星和HN82 表現中抗，病情指數在38.62～46.03 之間。19 份雜交組合中，05-574 × 207、05-574 × 20-2-5、05-574 × MD202表現抗病，病情指數分別為11.11、24.44、28.15。10 份商品種中，中甘107 和中甘108 表現抗病，病情指數分別為21.48 和25.93。

表3 55 份甘藍材料黑腐病的田間及室內苗期人工接種抗病性鑒定結果

2.4 甘藍黑腐病室內苗期人工接種抗病性鑒定結果

室內苗期人工接種抗病性鑒定結果表明（表3），自交系材料中，20-2-5 和05-574 表現高抗（圖3），MD202 表現抗病，21-3、721、YF 旺旺、多抗福星和HN82 表現中抗；雜交組合中，05-574 ×MD202 和05-574 × 207 表現抗病，05-574 × 20-2-5表現中抗；商品種中，中甘107 和中甘108 表現中抗。本次試驗中抗病對照21-3 的病情指數為30.33，抗性水平為中抗，感病對照BJ 的病情指數為79.60，抗性水平為高感，與孔樅樅（2019）的鑒定結果相符合，說明本次人工接種鑒定結果具有可靠性。

圖3 部分甘藍材料黑腐病田間和室內苗期人工接種抗病性鑒定表現

在本次人工接種鑒定中，大多數材料的抗性水平和田間抗性水平一致，但有6 份材料：自交系似柳生288 和CB521、雜交組合05-574 × 20-2-5 和721 × LY355、商品種中甘107 和中甘108 的抗性水平比田間抗性水平低，推測可能與田間溫度、濕度和黑腐病菌田間分布情況等因素有關。

從本試驗的總體結果來看，絕大多數材料的室內苗期人工接種抗病性鑒定結果與田間抗性鑒定結果一致，說明此次甘藍黑腐病田間抗性調查準確度較高，所制定的分級標準可用來反映甘藍結球期黑腐病田間發病狀況。

3 結論與討論

黑腐病是嚴重危害十字花科蕓薹屬作物的細菌性病害之一，由于抗源材料的缺乏，對甘藍類蔬菜作物的危害尤為嚴重。目前，國內外報道了極少數高抗黑腐病的甘藍材料，但大多由于材料抗性不穩定或者遺傳機制復雜而未能在育種研究中廣泛利用。

為了篩選甘藍黑腐病抗源材料和制定一套甘藍黑腐病田間病害分級標準，本試驗對種植在內蒙古烏蘭察布市的55 份甘藍材料進行田間抗病性調查，制定出一套適用于田間黑腐病抗性鑒定的分級標準，同時篩選出2 份高抗黑腐病的甘藍自交系材料05-574 和20-2-5。采用噴霧法對23 份甘藍材料進行室內苗期人工接種抗病性鑒定，驗證了該標準的可靠性。

本試驗中，選用了世界范圍內的黑腐病主流1號小種作為接種菌株來篩選材料，篩選出的甘藍材料抗病性強，應用范圍廣泛。在對55 份甘藍材料進行黑腐病田間抗病性調查時發現，材料的總體發病較均勻，材料間重復性整體較好；但同時發現，葉片的發病程度與土壤濕度有關，靠近土壤的葉片發病情況比上部葉片更為嚴重。甘藍結球期的田間抗性鑒定結果與室內苗期人工接種抗病性鑒定結果較符合，除個別材料抗性水平有差異外，大多數材料結果一致，說明本試驗調查結果及數據的準確度較高。

由于國內尚無統一的甘藍黑腐病田間病害分級標準，本試驗根據烏蘭察布地區55 份甘藍材料的發病整體情況初步制定了結球期甘藍黑腐病田間病級劃分標準，計算結果也相對符合材料發病情況，但是該標準是否適用于國內其他地區，今后還需進一步調查、反復比較和完善分級標準，使該標準適用于大多數地區。

根據本次抗病性鑒定結果可知，表現中抗或者抗病的多為扁球型材料。然而隨著我國蔬菜產業的發展，早熟性好、葉質脆嫩、球形較好的圓球型甘藍品種的市場逐漸增加，因此培育抗病且品質優良的圓球型品種成為我國甘藍育種的重要目標。本試驗中，圓球型甘藍雜交組合05-574 × 207 的田間抗性水平和室內苗期人工接種鑒定抗性水平均達到抗病，對后續的抗黑腐病甘藍育種工作具有一定的借鑒意義。