扶正膠囊提取物對環磷酰胺誘導的免疫低下小鼠免疫調節作用研究*

陳汀，成旭東，胡芳，陳婷，朱慧，唐樑

（南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院，蘇州 215009）

扶正膠囊是蘇州市中醫醫院自行研發的醫院制劑，依據中醫“扶正培本”“扶正驅邪”“正氣存內，邪不可干”的治療理論，由本院名老中醫何煥榮主任開發，采用生黃芪、西洋參粉和冬蟲夏草菌絲粉3味飲片組方而成。方中黃芪味甘、性溫，具有補氣升陽，固表止汗的功效，中國近代著名中西匯通派醫家張錫純認為黃芪“補氣之功最優，故推之為補藥之長”。[1]西洋參味甘、性涼，具有補氣養陰，清熱生津的功效?！皩τ萌藚ⅲ皇苋藚⒅疁匮a者，皆可用其代之?！币虼?，其與黃芪配伍可以中和黃芪的溫補之性，并增強補氣的功效。冬蟲夏草味甘、性平，具有補腎益肺，止血化痰的功效，3味藥共用可以共同增強該方益氣補腎的功效。

扶正膠囊作為本院自制制劑在臨床應用已十余年，2020年臨床應用55 000余盒，具有益氣補腎的功效，主要適用于免疫功能低下、疲勞綜合征及慢性疾病恢復期等疾病和證候。本院臨床研究表明扶正膠囊在用于治療肺癌癌因病疲乏和配合穴位敷貼治療穩定期肺腎兩虛型慢性阻塞性肺病方面均具有較好的臨床療效[2-3]。

本實驗采用環磷酰胺誘導建立小鼠免疫功能低下模型[4-6]，通過測定扶正膠囊提取物對小鼠單核細胞吞噬能力、胸腺和脾臟指數、血清中細胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-17（IL-17）含量及脾T淋巴細胞亞群CD3+T淋巴細胞（CD3+）、CD4+T 淋巴細胞（CD4+）與 CD8+T淋巴細胞（CD8+）的分布及比例等多個免疫學評價指標，來考察扶正膠囊提取物對小鼠免疫功能的調節作用，旨在探討扶正膠囊提取物的免疫調節活性，為該制劑的深入研究開發和免疫機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF清潔級的KM小鼠60只，雄性，體質量（18±2）g，購自上海靈暢生物科技有限公司，質量檢測單位為蘇州西山生物科技有限公司，動物許可證號SCK（滬）2018-0003。分籠飼養，每組10只，實驗前正常進食飲水，適應性喂養5 d。

1.2 藥物與試劑 生黃芪（批號：210130，產地：內蒙古）、西洋參粉（批號：200422，產地：加拿大）、蟲草被孢菌粉（批號：210324，產地：江蘇）均購置蘇州市天靈中藥飲片有限公司。

環磷酰胺（批號：0E385A），德國 Baxter Oncology Gmbh公司；香菇多糖（批號：B24117，質量分數≥98%），由上海源葉生物科技有限公司提供；小鼠 IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α 和 IFN-γ ELISA 試劑盒，購于江蘇晶美生物科技有限公司；印度墨汁（批號：0326A21），江蘇艾迪生生物科技有限公司；PBS（批號：8120015），ANTI-MO CD3e PE（批號：2172537），ANTI-MO CD4 FITC （批號：2007709），ANTI-MO CD8A APC（批號：2087760），均購置于賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 主要儀器 ME55型分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；紫外-可見分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司；KDC-140HR高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；流式細胞儀，美國BD公司；MQT-60R臺式全溫振蕩培養箱，上海旻泉儀器有限公司；Thermo Multiskan Sky全波長酶標儀，北京昊諾斯科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 扶正膠囊提取物的制備 按扶正膠囊處方取適量飲片，按處方生產工藝制備扶正膠囊內容物細粉；根據內容物質量，取10倍量純化水，煎煮2次，每次1 h，合并2次煎液，濃縮至一定體積，冷藏保存備用。

1.4.2 實驗動物的分組及干預方法 將60只SPF級的小鼠進行隨機分組，每組10只（組別為空白組、模型組、扶正膠囊提取物低、中、高劑量組以及陽性對照組）。

除了空白組外，模型組、扶正膠囊提取物低、中、高劑量組以及陽性對照組各組小鼠腹腔注射環磷酰胺80 mg/kg，每日1次，連續兩天；空白組小鼠按重量腹腔注射相同量0.9%生理鹽水。

實驗開始的第3天，扶正膠囊提取物低、中、高劑量組小鼠分別灌胃0.75、1.5、3 g（按生藥量計算）/kg濃度的扶正膠囊提取物溶液（相當于臨床單日用藥量的1、2、4倍），陽性對照組灌胃60 mg/kg的香菇多糖溶液，模型組和空白組小鼠灌胃等體積的蒸餾水，每日一次，連續給藥7 d；于末次給藥隔日，取血，處死，分離肝臟、胸腺和脾臟。

1.4.3 碳粒廓清實驗 預先準備好比色管，加入0.1%碳酸鈉溶液2 mL，備用；小鼠末次給藥24 h后，經尾靜脈注射已按1∶5比例稀釋的印度墨汁，注射劑量為0.1 mL/10 g；尾靜脈注射完成后，分別在注射后的2 min和12 min從眼內眥靜脈叢取血20 μL；分別加入含2 mL濃度為0.1%的碳酸鈉溶液的比色管中；通過紫外-可見分光光度計，于650 nm波長下測定吸光度（OD）值。

先計算碳粒廓清指數 K，K=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1），其中OD1值和OD2值分別為2min和12min時取出的血液樣本所測得的OD值；然后再計算吞噬指數 α，α=K1/3×（體質量/肝臟和脾臟質量）[3]。

1.4.4 臟器指數測定 脫頸椎處死小鼠后，解剖取小鼠脾臟和胸腺，用濾紙吸盡表面血漬，分別稱量臟器質量，計算脾臟（胸腺）指數。脾臟（胸腺）指數=脾臟（胸腺）質量（mg）/體質量（mg）。

1.4.5 血清中 IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α 和 IFN-γ水平檢測 各組小鼠血液樣本經高速冷凍離心機離心處理（轉速3 000 r/min，離心10 min），分離血清。取血清樣本，采用ELISA試劑盒進行檢測，依據試劑盒內說明書中的操作步驟逐步操作，測定血清中 IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α 和 IFN-γ 的含量。

1.4.6 脾臟淋巴細胞及其亞群分布檢測 無菌條件下分離小鼠脾臟，取無菌培養皿，采用組織研磨法分離小鼠脾臟，制備小鼠脾細胞懸液；采用細胞計數板，光學顯微鏡下計數細胞，調整細胞濃度至1×106個/mL。每組樣品分別取細胞懸液 100 μL，分別加入單克隆抗體CD3+-PE、CD4+-FITC、CD8+-APC 2.5 μL 標記細胞，避光保存 30 min，在 250×g、4℃條件下離心5 min，離心后棄去上清液，加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS），吹打混勻細胞后按上述條件離心，離心后再次棄去上清液，加入2 mL PBS重懸細胞，采用流式細胞儀檢測樣本，根據檢測結果計算各樣本中T細胞中CD3+CD4+與CD3+CD8+細胞亞群比例。

1.4.7 統計學方法 數據采用SPSS 24.0軟件統計，數據結果均以均數±標準差（±s）表示。多個組間的數據比較將采用單因素方差分析，兩組數據間的比較將采用LSD-t檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 扶正膠囊提取物對小鼠脾臟和胸腺指數的影響 與空白組結果相比，模型組的小鼠脾臟指數和胸腺指數均顯著降低（P<0.01）；與模型組結果相比，香菇多糖陽性對照組的小鼠脾臟指數和胸腺指數均顯著升高（P<0.01），扶正膠囊提取物低劑量組的脾臟指數明顯升高（P<0.05），中劑量組的脾臟指數呈顯著升高（P<0.01），高劑量組的脾臟指數呈顯著升高（P<0.01）胸腺指數呈明顯升高（P<0.05），表明扶正膠囊提取物可以逆轉由環磷酰胺所致的脾臟指數和胸腺指數降低。見表1。

表1 扶正膠囊提取物對小鼠脾臟和胸腺指數的影響（±s）

表1 扶正膠囊提取物對小鼠脾臟和胸腺指數的影響（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組動物數1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0胸腺指數（m g/g）- 3.9 6 3±0.1 9 6 2.4 7 1±0.1 4 6- 2.9 1 9±0.1 9 2** 1.8 1 1±0.1 5 2**6 0.0 m g/k g 3.2 1 7±0.2 3 9## 2.2 8 0±0.1 8 1##0.7 5 g/k g 3.1 7 8±0.2 6 0# 1.8 7 9±0.1 1 7 1.5 g/k g 3.3 1 4±0.2 8 5## 1.9 0 6±0.1 0 3 3.0 g/k g 3.5 2 4±0.2 4 8## 1.9 4 6±0.1 1 0#劑量 脾臟指數（m g/g）

2.2 扶正膠囊提取物對小鼠單核細胞吞噬能力的影響 與空白組結果相比，模型組小鼠的廓清指數K和吞噬指數α均呈顯著性降低（P<0.01）；與模型組結果相比，香菇多糖陽性對照組小鼠的廓清指數K和吞噬指數α均呈明顯升高（P<0.05），扶正膠囊提取物中、高劑量組小鼠的廓清指數K和吞噬指數α均呈明顯升高（P<0.05），且與扶正膠囊提取物的劑量呈正相關，說明扶正膠囊提取物可以明顯提高小鼠的單核細胞吞噬功能。見表2。

表2 扶正膠囊提取物對小鼠單核細胞吞噬能力的影響（±s）

表2 扶正膠囊提取物對小鼠單核細胞吞噬能力的影響（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別空白組模型組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組動物數1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0廓清指數K 吞噬指數α 0.0 3 5 3±0.0 0 4 7 6.6 8 9±0.3 1 5 0.0 2 4 8±0.0 0 2 1** 6.0 8 2±0.1 7 3**0.0 2 7 6±0.0 0 2 8# 6.2 5 8±0.2 0 0#0.0 2 7 1±0.0 0 1 7# 6.2 2 9±0.1 4 8 0.0 2 7 5±0.0 0 1 4# 6.2 4 7±0.1 0 9#0.0 2 8 3±0.0 0 3 7# 6.2 8 9±0.2 5 8#

2.3 扶正膠囊提取物對血清中IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α和IFN-γ水平的影響 與空白組結果相比，模型組血清中的IL-4和IFN-γ水平顯著降低（P<0.05，P<0.01）、IL-17和 TNF-α 水平顯著增高（P<0.01）。與模型組結果相比，香菇多糖陽性對照組血清中的IL-4與IFN-γ水平明顯增高（P<0.05），IL-17和TNF-α水平明顯降低（P<0.05）；與模型組結果相比，扶正膠囊提取物低、中、高劑量組均能顯著提升小鼠血清中的IL-4、IL-10和IFN-γ水平（P<0.01），并顯著降低小鼠血清中的IL-17和TNF-α水平（P<0.01），以上數據分析說明扶正膠囊提取物可以促進免疫抑制小鼠體內的IL-4、IL-10和IFN-γ表達，抑制IL-17和TNF-α表達，見表3。

表 3 扶正膠囊提取物對小鼠血清 IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ 水平的影響（±s）pg/mL

表 3 扶正膠囊提取物對小鼠血清 IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ 水平的影響（±s）pg/mL

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.05。

組別空白組模型組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組動物數6 6 6 6 6 6 I L-4 I L-1 0 I L-1 7 T N F-α I F N-γ 1 6 4.4 7±2 1.8 2 3 8 6.4 1±1 2.4 1 2 3.4 9±0.8 0 1 0 7 2.4 1±4 5.2 1 2 0 9 1.7 8±3 9.8 9 1 5 2.2 0± 2.9 4* 3 8 1.4 2± 4.4 2 3 1.1 2±1.4 5** 1 7 6 0.4 4±1 6.4 9** 1 9 3 5.4 9±1 8.4 1**1 7 5.7 4±2 2.5 2# 3 9 4.5 5±1 0.3 9 1 7.6 2±2.1 1# 1 1 5 9.4 7±3 2.8 1# 2 0 0 1.0 4±1 8.9 1##1 7 1.4 7±1 5.3 5## 5 7 5.4 5± 8.4 9## 2 2.8 7±1.6 6## 1 2 6 1.3 1±3 7.4 7## 2 0 8 6.4 1± 9.8 9##1 7 2.3±1 1.4 4## 4 0 2.4 4± 3.3 6## 2 1.9 1±0.9 9## 1 4 0 1.4 1±3 8.8 8## 2 2 6 5.1 8±1 0.1 3##1 8 8.1 3±1 2.3 2## 4 4 4.8 2± 6.6 4## 1 8.9 1±2.0 1## 1 4 3 5.1 9±1 7.4 1## 2 2 0 6.2 9±4 0.1 1##

2.4 扶正膠囊提取物對脾淋巴細胞CD3+CD4+與CD3+CD8+比值的影響 流式細胞儀檢測結果表明，與空白組相比，模型組的CD3+CD4+細胞表達程度和CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值均呈顯著性降低（P<0.01）；與模型組結果相比，陽性對照組的CD3+CD4+細胞表達程度呈顯著性升高（P<0.01），扶正膠囊提取物中劑量組的CD3+CD4+細胞表達程度和CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值均呈明顯升高（P<0.05），扶正膠囊提取物高劑量組的CD3+CD4+細胞表達程度和CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值均呈顯著性升高（P<0.01），CD3+CD8+細胞表達程度呈明顯降低（P<0.05）。結果見表 4、圖 1。

表4 扶正膠囊提取物對脾淋巴細胞CD3+CD4+與CD3+CD8+表達的影響（±s）

表4 扶正膠囊提取物對脾淋巴細胞CD3+CD4+與CD3+CD8+表達的影響（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

C D 3+C D 4+/C D 3+C D 8+空白組 3 3 3.5 3±0.9 6 7.0 7±0.2 8 4.7 4±0.0 5模型組 3 1 6.8 1±2.5 8** 1 0.4 9±2.5 5 1.7 3±0.7 6**陽性對照組 3 2 4.4 0±1.1 1## 8.7 8±3.1 8 3.0 2±1.0 1低劑量組 3 2 0.7 8±0.5 8 8.6 7±1.2 8 2.4 4±0.4 4中劑量組 3 2 1.8 5±1.5 9# 7.3 3±0.4 5 2.9 8±0.1 9#高劑量組 3 2 4.5 8±0.8 6## 6.2 1±0.2 3# 3.9 6±0.0 9##組別 動物數 C D 3+C D 4+（%）C D 3+C D 8+（%）

圖1 小鼠脾淋巴細胞亞群CD3+CD4+與CD3+CD8+分布結果

3 討論

在保障機體正常運行的過程中，人體免疫系統有重要地位。人體免疫系統無時無刻在保護著機體，抵御著真菌病毒等微生物侵入機體。當機體的免疫功能處于正常狀態時，可以抵御外界病原的入侵，預防疾病的發生，而當人體的免疫功能降低到不足以阻止病原入侵時，就容易患上各種疾病[7]。隨著人們對免疫相關的研究成果愈加重視，免疫功能相關的補益產品在改善人們生活質量方面就發揮著越來越重要的角色。中醫藥在調動內在抗病能力與調節機體的免疫力方面有著色彩分明的特色，蘇州中醫醫院自行研發的中成藥扶正膠囊，由名老中醫何煥榮主任開發，采用黃芪、西洋參和冬蟲夏草菌絲體共同組方而成，具有益氣補腎的作用，適用與免疫功能低下、疲勞綜合癥及慢性疾病恢復期等疾病的治療，是一款很好的免疫調節類醫院中藥制劑。

環磷酰胺作為一種常見的免疫抑制劑，它可以通過殺傷免疫細胞，從而影響機體免疫調節的各個階段而起到免疫抑制作用[8]；可通過腹腔注射或肌肉注射環磷酰胺，來建立動物免疫抑制模型。本實驗采用環磷酰胺建立小鼠模型后，與空白組相比，發現模型組小鼠的脾臟指數和胸腺指數明顯降低，小鼠單核細胞的吞噬功能顯著降低，血清中IL-17和TNF-α水平升高、IL-4和IFN-γ水平顯著降低，脾淋巴細胞亞群CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值顯著降低，實驗結果與相關研究報道一致[9-12]，說明本實驗造模成功。T淋巴細胞亞群是評價抗腫瘤免疫的重要指標。T淋巴細胞（CD3+）主要分為CD3+CD4+和CD3+CD8+亞群。CD3+CD4+T淋巴細胞的增加和CD3+CD4+/CD3+CD8+的比例增加表明T淋巴細胞介導的抗腫瘤免疫水平增強[13]。

扶正膠囊由生黃芪、西洋參、蟲草菌絲粉3味飲片組成，實驗研究表明這三味飲片中的多種成分具均具有免疫調節作用，如黃芪中的黃芪甲苷[14]和黃芪多糖[15]，西洋參中的皂苷類成分[16]和西洋參多糖[17]，蟲草菌絲中的蟲草素[18]和蟲草多糖[19]，同時該類飲片聯合使用較單獨使用具有更好的免疫調節作用[20]。本研究結果表明：扶正膠囊提取物可以逆轉由環磷酰胺導致的胸腺指數和脾臟指數降低，提高免疫抑制小鼠的單核細胞吞噬功能，促進免疫抑制小鼠血清中IL-4、IL-10和IFN-γ因子表達水平，抑制IL-17和TNF-α的表達水平，提升免疫抑制小鼠脾淋巴細胞亞群CD3+CD4+細胞的表達程度和CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值。說明扶正膠囊提取物可以促進機體免疫器官的恢復，調節機體免疫相關功能和指標，從而實現增強機體免疫功能的作用。與陽性對照組對照，扶正膠囊提取物的免疫調節作用較好，具有良好的開發價值，通過本研究為該制劑的深入開發提供了一定的實驗依據。