甘草養陰湯在改善小鼠銀屑病樣皮損和調節炎癥反應中的作用*

吳惠梅 ，陳永 ，肖長虹 ，Kutty Selva Nandakumar

（1.南方醫科大學藥學院，南方醫科大學-卡羅林斯卡研究所聯合炎癥研究中心，廣州 510515；2.深圳市人民醫院（暨南大學第二臨床醫學院、南方科技大學第一附屬醫院）風濕免疫科，深圳 518020；3.南方醫科大學中西醫結合醫院風濕科，廣州 510315）

銀屑病是由遺傳和環境因素共同導致的一種免疫介導的慢性、炎癥性、全身性疾病[1]。銀屑病患病率高且容易復發；歐洲和北美的患病率約為2%[1]，在丹麥為7.9%[2]。除了全身皮膚病變表現外，銀屑病患者罹患心血管疾病、代謝綜合征和銀屑病關節炎的風險也增加[3]。盡管目前臨床運用多種免疫抑制劑或者生物制劑，但療效仍不盡人意，并且當前治療方式多會帶來一系列不良反應，極大影響患者的生活質量[4]。

銀屑病在中醫被稱為“白疕”，而中藥用于銀屑病患者的治療具有悠久的歷史淵源[5]。根據中醫理論：“血熱生風”是常見的銀屑病的辨證類型。中醫上選擇了具有陰、涼性質的藥物來治療銀屑病。盡管現代科學技術能夠提取中草藥的一些有效成分，但在臨床實踐中，以中藥復方是中醫臨床處方的基本原則[6]。基于中藥配方及中草藥成分的功效，結合中醫配伍原則，設計出包含甘草、人參、干姜、蒲公英、羅漢果、玉竹、大棗7種中藥成分（專利申請號：201910843519.9）的滋陰中藥，并將其命名為“甘草養陰湯（GNY）”。該配方的中草藥提取物的抗炎功能有大量研究報道。例如，甘草中的二氫磺基苯甲酸酯能夠穩定自由基的產生、并通過減少人類全血樣本中的血栓烷 B2（TXB2）和前列腺素 E2（PGE2）的釋放而顯示出抗氧化和抗炎活性[7]。甘草的提取物甘草酸苷可用于治療尋常型銀屑病且能夠調節Th17細胞（Th17）及其相關細胞因子的表達[8]。人參多糖提取物能夠抑制白細胞介素-8（IL-8）的分泌和Th1細胞的分化等[9]。人參皂苷可以調節小鼠脾臟中樹突狀細胞（DC）的不同亞群而緩解小鼠的類風濕性關節炎[10]。人參皂苷可抑制樹突細胞成熟遷移和歸巢，減少T細胞的活化[11]。針對該配方，前期在自身免疫性疾病類風濕關節炎及潰瘍性結腸炎的基礎研究及臨床病例中顯示治療價值[12-13]。

在本研究中，用咪喹莫特（IMQ）誘導了銀屑病小鼠模型，通過研究GNY對炎癥細胞和細胞因子影響，探索其治療銀屑病及其他自身免疫性疾病的的潛在作用機制，為GNY用于銀屑病等自身免疫性疾病患者的臨床試驗奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 實驗采用8周齡的BALB/c雌性近交小鼠。購自南方醫科大學實驗動物中心（批準號：CUMS-2018-0062-03）。SPF級環境飼養，自由攝取水和食物。

1.2 IMQ誘發銀屑病小鼠模型 將小鼠分為4組[對照組（CTRL）、模型組（IMQ）和不同濃度藥物治療組包括GNY-2.5 g/kg和GNY-5 g/kg組]，每組8只。除對照組外，所有組的每只小鼠在背部的剃毛區局部給藥每日30 mg，連續5日的IMQ以誘導銀屑病[14]。使用IMQ的所有小鼠均出能現銀屑病樣皮膚炎癥，顯示模型建立成功。

1.3 GNY的制備 GNY的成分如下：甘草、人參、羅漢果、蒲公英、玉竹、干姜、大棗，按照比例12∶9∶12∶6∶9∶6∶18。將中藥飲片煮沸兩次，持續 1 h，然后用雙蒸餾水（ddH2O）稀釋到2.5 g/kg和5 g/kg濃度的藥液。

1.4 干預措施和癥狀評估 GNY-2.5 g/kg和GNY-5 g/kg組的小鼠在飲用水中加入相應濃度的GNY。在第10天，當所有組中的銀屑病樣病變炎癥消退時，第二次應用IMQ，連續5天（如圖1A所示）。使用銀屑病面積和嚴重程度指數（PASI）來檢測銀屑病癥狀，該評分包括：紅斑（0-4）、鱗片（0-4），皮膚厚度（0-4），總計12分。使用電子游標卡尺在特定受損皮膚區域測量皮膚厚度。

1.5 組織病理學評估 在銀屑病造模期結束時（第14天），通過肌肉內注射 Zoletil 50（Virbac，France，20 mg/kg）使小鼠麻醉，并通過斷頸法處死。收集皮膚樣品用于組織病理學分析。通過常規步驟進行HE染色，光學顯微鏡下觀察。使用×10放大倍數從每只小鼠的皮膚切片中選擇10個隨機區域來測量表皮厚度、使用Baker評分[9]來判斷銀屑病的病理學損害程度。

1.6 免疫組織化學和免疫熒光染色 在銀屑病末期（第14天）收獲皮膚樣品，每組5只小鼠。用生物素抗小鼠 Gr-1（Ly6C/6G）、CD11c（Biolegend，美國）對炎癥細胞進行常規免疫組化染色。然后在顯微鏡下觀察。免疫熒光染色：皮膚樣品常規包埋并切片，然后將切片在冰上用丙酮固定10 min，然后浸入PBS中15 min。用含2%BSA的PBST（Biofroxx，德國）封閉45 min。用兔單克隆抗體轉化生長因子β（TGF-β，Affinity Biosciences，中國）和維甲酸受體相關的孤兒受體γt（RORγt，Abcam，英國）在室溫下孵育組織1 h。然后加入熒光標記的抗兔二抗，并在室溫下孵育 60 min（碧云天，中國），4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（碧云天）溶液用于細胞核染色。使用共聚焦顯微鏡（Cannon，日本）拍攝照片。

1.7 流式細胞分析 為了探索每組小鼠中Th17和調節性T細胞（Treg）的水平，在處死小鼠后收集脾細胞。通過研磨制備單細胞懸液，并在避光環境下與抗特定細胞表面標記的抗體在冰上孵育30 min。Th17細胞用CD4+-APC和IL-17A+-PE抗體進行標記。Treg細胞用CD4+-PE，CD25+-APC，和叉頭框蛋白 P3（Forkhead box protein P3，Foxp3）+-BV570 標記。以上抗體均購置于BD Biosciences公司。使用LSR Ⅱ（BD Biosciences）流式細胞儀進行細胞分析，并使用Flow Jo軟件v 7.6（Tree Star，美國）進行結果分析。

1.8 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR） 使用Trizol（Invitrogen，美國）從皮膚中提取出總RNA，并溶解在無RNAse的RQ-DNAse水（Promega，美國）。使用PrimeScript RT試劑盒（Thermo Scientific，英國）對mRNA樣本進行反轉錄。qRT-PCR反應使用 SYBR Premix Ex Taq II TliRNaseH Plus（Takara biotech，日本）體系，使用 LightCycler 96（Roche，瑞典）熱循環儀進行PCR擴增。采用β-肌動蛋白（βactin）作為內參，用于計算轉錄本相對表達量，并使用2-ΔΔCt算法計算相對表達水平。重復實驗三遍以確認結果。

qRT-PCR目標基因的引物序列如下所列：βactin（ACCGTGAAAAGATGACCCAG，GTACGACCA GAGGCATACAG）；TNF-α（ACGCTCTTCTGTCTACT GAACT，ATCTGAGTGTGAGGGTCTGG）；IL-6（GAG AAAAGAGTTGTGCAATGGC，CCAGTTTGGTAGCAT CCATCAT）；IL-10（CTGCTAACCGACTCCTTAATGC，GCTCCACTGCCTTGCTCTTAT）；TGF-β（ATCTCGAT TTTTACCCTGGTGGT，CTCCCAAGGAAAGGTAGGT GATAGT）；AMPK-ɑ1（TGTGGCTGGGTGTGTAAA，GGCTGTGTGTGGCATTC）；IL-17A（CCCCTAAGAAA CCCCCACG，TAAAGTCCACAGAAAAACAAACACG）；IL-17E（ACAGGGACTTGAATCGGGTC，TGGTAAAG TGGGACGGAGTTG）；IL-17F（GTCAGGAAGACAGC ACCA，AGCCAACTTTTAGGAGCA）；IL-22（CATGCA GGAGGTGGTACCTT，CAGACGCAAGCATTTCTCAG）；IL-23（AGCAACTTCACACCTCCCTAC，ACTGCTGA CTAGAACTCAGGC）。

1.9 統計分析 使用GraphPad Prism 8軟件分析數據，結果表示為均值±標準差（±s）。兩組之間使用Student t檢驗進行比較，使用 Bonferroni或Newman-Keuls校正進行單向方差分析作多次比較。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 GNY改善小鼠銀屑病的臨床癥狀、減輕角質細胞過度增厚 實驗方案如圖1A所示。在對BALB/c小鼠用IMQ誘導5 d后（圖1A），皮膚出現典型的紅斑、鱗屑和厚度增加，且總PASI高達7分，表明咪喹莫特誘導銀屑病模型成功建立。GNY能夠在4，5，6 d及IMQ二次免疫后顯著降低紅斑評分。GNY-2.5 g/kg和GNY-5 g/kg組能夠在第4～6天，第14天顯著降低鱗屑評分（P<0.05）。GNY-2.5 g/kg組在第 10、11、13、14 天降低皮膚厚度（P<0.05）。即GNY能夠在第1次IMQ誘導的銀屑病高峰期（第4～6天）及IMQ二次免疫后顯著性的降低銀屑病評分，且在第2次IMQ誘導后，GNY的治療效果更加明顯，且GNY-2.5 g/kg組治療效果優于GNY-5 g/kg組（圖1B）。IMQ二次免疫后第14天的小鼠背部皮膚圖片證明以上特點（圖1C）。

圖1 GNY改善小鼠IMQ誘導的銀屑病癥狀

在兩個治療組（GNY-2.5 g/kg和GNY-5 g/kg）中，皮膚病變的HE染色顯示表皮增厚、棘皮癥、角化不全比模型組低（圖1D）。同時，GNY湯治療組能夠顯著性降低上皮的浸潤程度厚度（圖1E）和組織的病理評分（圖1F）。

2.2 GNY降低皮膚中Gr-1，CD11c和RORγ t陽性細胞的表達 粒細胞受體-1（Gr-1）是一種髓樣分化抗原，在粒細胞和巨噬細胞上表達的糖基磷脂酰肌醇（GPI）相關蛋白[15]，參與自身免疫性疾病的發病機制[16]。CD11c在單核細胞和巨噬細胞上與CD1c（BDCA-1）共表達。真皮髓樣CD11c+DC可激活CD4+T細胞并進一步誘發銀屑病的炎癥反應[17]。在本研究中，觀察到銀屑病模型小鼠比對照組小鼠表達更高水平的Gr-1和CD11c，而GNY以劑量依賴性方式降低了它們的表達（圖2A和B）。研究顯示在銀屑病中Th17細胞產生IL-17A細胞因子，這可以通過RORγt進行特異性標記[17]。在銀屑病模型小鼠的真皮中，觀察到RORγt陽性細胞的存在（1～3個細胞/切片），而在對照和GNY藥物處理的小鼠中均未見RORγt陽性細胞（圖2C）。TGF-β可促進Th17細胞發育[18]。本研究顯示與健康小鼠相比，銀屑病模型小鼠表達更高數量的TGF-β+細胞。在GNY作用下降低了TGF-β+細胞的表達（圖2C）。

圖2 GNY抑制IMQ誘導銀屑病小鼠模型中的非特異性和特異性免疫細胞

2.3 GNY調節脾臟的Treg和Th17細胞 脾臟T細胞亞群的結果表明，模型小鼠CD4+IL-17+Th17細胞百分比增加，而CD25+Foxp3+Treg細胞減少。Th17細胞是自身免疫和炎癥的促進劑，而Treg細胞則可以抑制這些現象并保持免疫穩態[19]。在兩種濃度的GNY中，分化的CD4+IL-17+Th17細胞均顯著降低（圖3A），而脾臟中的CD25+Foxp3+Treg細胞在GNY干預后增加（圖3B）。

圖3 GNY調節脾臟Treg/Th17細胞

2.4 GNY減少小鼠銀屑病皮膚的多種炎性細胞因子表達 銀屑病患者血清中細胞因子，細胞因子受體及其信號轉導途徑的復雜網絡升高[20]。本研究通過qPCR實驗對皮膚樣品中IL-6、IL-10、IL-17A、IL-22、IL-23、TNF-α、TGF-β 和腺苷酸活化蛋 A 激酶（AMPactivatedproteinkinase，AMPK-ɑ1）的相對mRNA表達水平進行了半定量分析。發現，除IL-10外，模型小鼠的血清中所有這些mRNA均升高，而GNY治療后可顯著降低炎癥因子及AMPK-ɑ1表達（圖 4）。

圖4 GNY降低牛皮癬小鼠模型真皮中的炎癥細胞因子水平

3 討論

自擬方GNY，是根據中醫理論、藥物的性味、歸經，結合多位中醫學專家意見進行討論擬定的針對自身免疫性疾病的中藥復方。方中甘草益氣補中，清熱解毒為君藥；人參補氣、生津，玉竹養陰潤燥，協調甘草作用，并消除其水鈉潴留的副作用，為臣藥。蒲公英、羅漢果清熱解毒，干姜溫中散寒，回陽通脈，屬于佐藥；大棗養血安神、緩和藥性為使藥。整個配方陰陽調和、滋陰為主，陰中求陽；對機體的陰陽失調形成了“緩沖液”樣作用。

根據GNY所含成分的功效，主要是滋陰。“陽亢”在中醫診斷中可表現為“上火”，即過多的陽氣或心火旺盛與自身免疫反應或炎性癥狀相關。IMQ誘導的銀屑病小鼠是研究自身免疫和炎性疾病的代表性動物模型，在一定程度上可以看作是上火、陰虛陽亢的模型。在本研究中，GNY該模型臨床表現和角質形成、細胞增殖有明顯改善作用。非特異性和特異性免疫反應在銀屑病發病機理中起到重要作用[23-24]，所以本研究初步探索了GNY的治療機制，涉及非特異性和特異性免疫反應。結果證實，治療組在用藥后炎癥反應減輕，Gr-1、CD11c和RORγt陽性細胞降低。Gr-1是在粒細胞和巨噬細胞上表達的特異性標記。CD11c主要在非特異性免疫細胞如單核細胞、DC、粒細胞、NK細胞以及T細胞和B細胞的亞群上表達，它是用于鑒定皮膚髓樣DC的最顯著的表面抗原[26]。研究顯示銀屑病皮膚真皮中CD11c+髓樣DC的數量增加，在銀屑病的發病機理中具有重要作用[27]。RORγt在Th17細胞的分化、維持和功能中起關鍵作用，并且是治療IL-17介導的自身免疫性疾病的重要靶標[28]。在本研究中，觀察到僅在模型組的真皮中存在RORγt陽性細胞，而在健康對照組和GNY治療組中未能發現RORγt陽性細胞。

銀屑病患者中存在TGF-β信號的失調[29]，TGF-β促進Th17細胞的發育[27]。本研究發現GNY可降低IMQ誘導的銀屑病小鼠皮膚中TGF-β的表達。據此推測Th17細胞可能是GNY治療銀屑病的作用機制的靶細胞之一。通過流式細胞儀分析了Th17細胞的百分比，結果顯示在用GNY治療后，該群細胞顯著減少。CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞對銀屑病炎癥發揮調控作用[30]。在本研究中，模型組中的CD25+Foxp3+Treg細胞減少，GNY給藥組顯著增加。

本研究還觀察了IL-17A和IL-6、IL-10、IL-22、IL-23、TGF-β和TNF-α等mRNA基因的表達變化。這些靶點均與IL-17形成密切的通路關系[31-33]。除IL-10外，研究證實GNY可以下調此類炎癥因子水平。此外，還測試了AMPK/IL-17信號通路，AMPKɑ1在自身免疫反應中會增加，并通過調節代謝水平發揮一直炎癥的作用[34]，并且在炎癥反應控制后趨于正常水平[35]。在本實驗中，銀屑病小鼠模型中GNY治療后AMPK-ɑ1的mRNA的升高水平顯著降低，這說明炎癥水平得到了較好的控制。

本研究使用IMQ誘導的銀屑病小鼠模型，分析了自擬方GNY的治療效果。研究結果顯示PASI分數的降低，證實GNY湯的有效性。免疫組化、免疫熒光、流式細胞技術和qPCR分析進一步揭示了其效率和作用機理。因此，本研究顯示了GNY對動物模型的出色療效，證實了抗炎反應。這些結果將成為使用GNY湯治療銀屑病設計未來臨床試驗基礎。