毛酸漿內酯誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的機制研究*

余雅琴，何昕雅，張強，康寧

（天津中醫藥大學中西醫結合學院，天津 301617）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發病率與病死率呈現逐年上升的趨勢[1]。目前，常用的化學治療藥物因存在毒副作用大等問題而限制其在臨床上廣泛使用[2-3]。因此，急需開發高效低毒治療乳腺癌的新型藥物。

乳腺癌發病病機復雜，郭艷靜等認為痰濁、熱毒等邪氣盛實為乳腺癌發病的主要原因；劉玲琳等提出“痰毒瘀結”的病機學說，認為“痰毒瘀結、癌毒內生”是乳腺癌發生發展的核心病機。由此可見，熱毒、痰濁是乳腺癌發生的重要原因[4]。“熱者寒之”“結者散之”的清熱解毒散結法是乳腺癌中醫治療的基本法則之一。研究表明清熱解毒類中藥活性成分，如苦參堿、小檗堿、冬凌草甲素等[5]，均具有良好的抗乳腺癌效果。

腫瘤的發生主要是因細胞死亡失控導致的細胞無限增殖，而細胞凋亡又稱為Ⅰ型程序性細胞死亡，大量研究顯示抑制凋亡可顯著促進腫瘤進展[6]，因此，誘導腫瘤細胞凋亡是當前治療腫瘤的重要方法之一，也是篩選抗癌藥物的重要手段。近年來，相關研究發現中藥活性成分能夠高效地誘導腫瘤細胞凋亡[7]，這不僅為腫瘤的治療提供了新的思路，同時也為中藥的開發利用拓展了新的方向。毛酸漿（Physalis pubescens L.）又名黃菇娘，為茄科酸漿屬草本植物，可藥食兩用，性味酸平，歸肺經，其性寒涼，有清熱解毒、化痰利咽之功效[8]。現代藥理學研究表明毛酸漿具有抗腫瘤、抗氧化及抗炎等多種活性[9-10]，毛酸漿內酯（PPB）是從毛酸漿中分離提取的一種主要的睡茄內酯類化合物。據報道，PPB具有顯著抑制腎癌及肝癌增殖的作用[11-12]。本課題組前期研究也發現PPB可以明顯抑制乳腺癌細胞增殖，但其抗乳腺癌的相關分子機制尚不明確。本研究將首次考察PPB對人乳腺癌MCF-7細胞的生長抑制作用及相關機制，為PPB應用于乳腺癌治療提供理論基礎及實驗依據。

1 材料方法

1.1 細胞和試劑 人乳腺癌MCF-7細胞購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；新鮮AB型人血小板白膜層（100 mL）購于天津市血液中心；PPB由本課題組制備，具體制備方法詳見參考文獻[13]，其為白色粉末狀固體，經高效液相色譜（HPLC）鑒定純度≥96%，分子結構如圖1所示。PPB用二甲基亞砜（DMSO）在無菌環境中溶解，于-20℃儲存。藥品使用前，用RPMI-1640培養基稀釋至所需濃度，保證DMSO的終濃度小于1‰；RPMI-1640培養基（美國Gibco公司，31800022）；胎牛血清（以色列 BI公司，貨號：04-001-1ACS）；青鏈霉素混合液（P1400）、MTT噻唑藍（M8180）及BCA蛋白試劑測定盒（PC0020）均購于索萊寶生物科技有限公司；甲紫溶液（保定市金鐘制藥有限公司，H13020953）；抗-FADD抗體（貨號：sc-271748，玻利維亞Santa Cruz公司）；抗-Bax抗體（貨號：50599-2）、抗-Bcl-2抗體（貨號：12789-1）、抗-PARP抗體（貨號：13371-1-AP）、抗-Caspase-7 抗體（貨號：27155-1-AP）、抗-Caspase-8抗體（貨號：10380-1-AP）及抗-Caspase-9抗體（貨號：13423-1-AP）均于中國Protein Tech公司；抗-β-actin抗體（貨號：TA-09，中國 ZSGB-bio公司）；二抗辣根酶標記山羊抗鼠IgG（貨號：bs-0296G-Bio）及山羊抗兔 IgG（貨號：bs-0295G-Bio）購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 儀器 倒置相差顯微鏡（Leica公司，DMI1），酶標儀（Bio Tek公司，SN 254962），全自動化學發光分析系統（Tanon，5 200），電泳儀及轉膜儀（Bio-Rad Laboratories，1658033），超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司，SW-CJ-2F），臺式離心機（Eppendorf，5810R），CO2恒溫培養箱（Heal Force，HF90）。

1.3 細胞培養 人乳腺癌MCF-7細胞用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及10 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基，并置于 37℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養。待細胞生長融合率達≥85%時以1∶3的傳代比例進行傳代培養。

1.4 MTT實驗 取穩定對數生長期的MCF-7細胞，以3.0×104個/mL的細胞濃度均勻接種于96孔培養板中，每孔100 μL。培養箱培養24 h后，棄去孔內原有培養基，每孔加入 0、4、8、16、32、64 μmol/L PPB 100 μL，抑制劑作用時預處理1 h，每組至少有3個復孔。加藥完畢后，繼續孵育培養至不同時間后，棄去孔內液體，每孔于避光條件下加入5 mg/mL MTT 100 μL，繼續孵育 2.5 h，最后棄去 MTT，每孔加入DMSO 150 μL，用酶標儀在490 nm波長下，測定每孔吸光度（A值），并按以下公式計算抑制率：

1.5 人外周血單核細胞（hPBMC）的分離制備 無菌環境下分裝AB型人血小板白膜層，每管約10mL，加入PBS進行洗滌，以2 000 rpm離心10 min，離心半徑為18 cm，總共洗滌3次。離心所得細胞用含2%人AB型血清的RPMI-1640培養基重懸，以2.0×106個/孔接種于96孔U型細胞培養板，放入恒溫培養箱中培養，3 h 后棄去上清液，分別加入 1、2、4、8、16、32μmol/LPPB100μL，培養24h及48h后，用MTT法測定細胞抑制率。

1.6 結晶紫染色法檢測細胞的克隆形成能力 將對數生長期的細胞以1.0×103個/孔接種于6孔板中，每孔含2 mL培養基，將6孔板置于培養箱中培養，24 h 后加藥組每孔加入 0、4、8 及 16 μmol/L PPB 2 mL，藥物作用48 h后更換為完全培養基，且每過48 h換液1次，直至培養7 d，最終使單個細胞增殖6次以上，單個細胞形成克隆細胞數量至少為50個。染色前用90%乙醇固定10 min后棄去，用PBS清洗3次，并加入0.1%的結晶紫溶液染色10 min后，繼續清洗4次，待孔內干燥后觀察PPB對克隆形成的影響，拍照記錄克隆形成的形態變化并統計克隆形成的數量。

1.7 Western Blot法 取對數生長期的細胞以15.0×103個/孔接種于6孔板中，PPB處理細胞48 h后分別收集上清液并消化、收集細胞，加入100 μL RIPA裂解，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品的蛋白濃度。依據蛋白濃度在相應樣品中加入對應5×上樣緩沖液，沸水浴使蛋白變性，待樣品降至常溫后將其儲存于-20℃保存。實驗時，經過電泳、轉模及封閉等處理，使用相關一抗4℃孵育過夜后用辣根過氧化物酶標記的相應二抗常溫孵育1 h，洗條帶時用TBST漂洗10 min，重復3次。結束上述操作后，最后條帶放入ECL化學發光顯影儀顯影曝光。實驗所得條帶，用Tanon Gel Imaging System進行定量分析。

1.8 統計學分析 實驗結果采用SPSS 20.0統計軟件進行單因素方差分析（ANOVA）。所有實驗都至少重復3次。統計數據均以均值±標準差（±s）表示。P＜0.05時認為統計學差異分析有顯著意義。

2 結果

2.1 PPB對人乳腺癌MCF-7細胞及正常人外周血單核細胞（hPBMC）的生長抑制作用 結果如圖2所示，PPB呈時間和劑量依賴性抑制MCF-7細胞增殖，其中48 h時的半數抑制濃度（IC50）為11.24±2.84 μmol/L。克隆形成實驗結果如圖3所示，PPB以劑量依賴性方式抑制MCF-7細胞的克隆形成能力，且 8、16 μmol/L PPB 組與對照組（0 μmol/L）相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。此外，PPB對hPBMC 無明顯細胞毒性（圖 4），24 h IC50為（252.34±126.24）μmol/L，48 h IC50為（92.93 ± 35.93）μmol/L。綜上，PPB具有抑制人乳腺癌MCF-7細胞生長的作用，而對正常細胞毒性很低。

圖1 PPB的分子結構示意圖

圖2 PPB對MCF-7細胞增殖的影響（n=5）

圖3 PPB對MCF-7細胞克隆形成的影響（±s，n=4）

圖4 PPB對hPBMC細胞增殖的影響（n=3）

2.2 PPB抑制人乳腺癌MCF-7細胞生長的作用機制

2.2.1 PPB誘導人乳腺癌MCF-7細胞發生凋亡 為了考察PPB是否能誘導人乳腺癌MCF-7細胞發生凋亡，本實驗采用Western blot法考察相關凋亡蛋白的變化，結果如圖5所示，PARP及Caspase-7的原型形式蛋白表達以PPB劑量依賴性方式顯著減少，而其活性形式Cleaved PARP和Cleaved Caspase-7蛋白表達以PPB劑量依賴性方式顯著增加。進一步，引入泛Caspase抑制劑Z-VAD-fmk考察Caspase在PPB誘導的MCF-7細胞死亡中的作用，如圖6所示，與單加 PPB 組相比，預處理 Z-VAD-fmk（30 μmol/L）可顯著抑制MCF-7細胞死亡（P＜0.05），提示Caspases家族相關蛋白參與PPB誘導MCF-7細胞凋亡過程。綜上結果說明PPB可通過誘導Caspase依賴的細胞凋亡抑制乳腺癌MCF-7細胞生長。

圖5 PPB對特征性凋亡蛋白PARP和Caspase-7的影響（±s，n≥3）

圖6 Z-VAD-fmk對PPB誘導MCF-7細胞死亡的影響（±s，n=7）

2.2.2 PPB誘導人乳腺癌MCF-7細胞發生內源性和外源性凋亡 為進一步考察PPB誘導MCF-7細胞發生凋亡的具體途徑，本實驗采用Western Blot法進一步考察了PPB處理MCF-7細胞后內、外源凋亡途徑相關蛋白的變化，如圖7所示，PPB劑量依賴性的下調MCF-7細胞中Bcl-2、Caspase-9的表達，并顯著上調 Bax、Cleaved Caspase-9、Cytochrome c表達，提示PPB誘導MCF-7細胞發生內源性凋亡；與此同時，外源性凋亡蛋白Caspase-8的原型形式表達量顯著減少，而Fas、FADD與Cleaved Caspase-8的表達量均顯著上升（圖8）。上述結果表明，PPB可誘導MCF-7細胞發生內源性和外源性凋亡。

圖7 PPB對內源性凋亡蛋白的影響（±s，n≥3）

圖8 PPB對外源性凋亡蛋白的影響（±s，n≥3）

3 討論與結論

乳腺癌嚴重威脅女性健康，近年來，中醫藥在乳腺癌方面的研究及應用已取得一定的成果[14]，然而中藥及其有效成分的開發利用尚不完全，且其潛在的抗癌機制仍未完全闡明，因此需進一步的深入研究。

目前清熱解毒類中藥的活性成分在抗乳腺癌方面研究廣泛[15]。例如黃連的主要有效成分小檗堿可通過抑制周期阻滯、凋亡或自噬等方式誘導乳腺癌細胞死亡[16]。穿心蓮主要活性成分穿心蓮內酯可促進細胞凋亡及周期阻滯進而促進宮頸癌細胞死亡[17]。此外，蒲公英萜醇還可通過抑制mTOR信號通路誘導MCF-7細胞發生自噬[18]等，這些研究均證實清熱解毒類中藥的活性成分抗乳腺癌作用顯著。本研究中毛酸漿屬于清熱解毒類中藥，可藥食兩用，PPB則是從毛酸漿中提取的一種睡茄內酯類化合物。已有研究顯示PPB對腎癌具有顯著的細胞毒性[12]。本研究則發現PPB以時間和劑量依賴性的方式降低人乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力，并可顯著抑制MCF-7細胞的克隆形成；hPBMC為正常人外周血單核細胞，本研究顯示PPB對hPBMC無明顯毒性，表明PPB的細胞毒有選擇性，因此PPB具有成為高效低毒的新型抗腫瘤藥物的潛力，這與之前報道的睡茄內酯類化合物具有開發成為乳腺癌治療候選藥物的報道相一致[19-20]。

促進腫瘤細胞凋亡是多種中藥有效成分抗腫瘤的重要方式之一。據報道，睡茄內酯類化合物可以誘導腫瘤細胞凋亡，如Physapruin A可通過抑制乳腺癌細胞增殖，并通過誘導細胞凋亡及引起DNA損傷發揮促進乳腺癌細胞死亡的作用[20]；Physapubescin Ⅰ可有效地抑制人胰腺癌SW1990細胞增殖并促進其凋亡[21]。本研究則運用Western Blot法檢測了睡茄內酯類化合物PPB處理人乳腺癌MCF-7細胞后PARP及Caspase-7的變化情況。細胞凋亡標志性蛋白PARP為Caspases的切割底物，被激活的Caspase-7能夠降解PARP，引發級聯反應，參與細胞凋亡的執行過程，因此二者在調節腫瘤細胞發生發展中起至關重要的作用[6，22-23]。結果顯示，不同劑量PPB作用于MCF-7細胞后PARP、Caspase-7顯著減少，而Cleaved PARP、Cleaved Caspase-7顯著增加，提示PPB也可誘導MCF-7細胞發生凋亡[24]。

在內源性凋亡途徑中，調節細胞凋亡的關鍵是Bcl-2（B-cell lymphoma 2）蛋白家族[25]，且 Bcl-2 與乳腺癌密切相關[26]。當細胞在特定刺激下，Bax/Bcl-2比例上調，引起線粒體膜通透性的改變，從而促進細胞色素 c（Cytochrome c）從線粒體釋放[27]，并與凋亡酶激活因子-1（Apaf-1）相互作用，形成凋亡復合體并激活Caspase-9，最終導致細胞發生凋亡[25]。在本研究中，PPB呈劑量依賴性方式誘導MCF-7細胞內源性凋亡蛋白 Bax、Cleaved Caspase-9、Cytochromec顯著上調，Bcl-2、原型Caspase-9顯著下調，進一步證實了文獻報道，即睡茄內酯類化合物可通過促進內源性凋亡途徑的發生進而誘導腫瘤細胞死亡[25，28]。

在外源性凋亡途徑中，當Fas與配體FasL結合后，Fas三聚化進而與FADD結合，募集Caspase-8前體蛋白形成死亡誘導信號復合體（DISC），DISC中的Caspase-8自我剪切成具有活性的Caspase-8，順勢啟動下游的Caspase級聯反應，激活凋亡執行通路從而完成凋亡過程[25]，研究顯示Caspase-8/FADD對細胞增殖有直接影響[26]。有關睡茄內酯類化合物通過外源性凋亡途徑促進腫瘤細胞死亡的報道較少。然而，本研究卻發現，外源性凋亡相關蛋白Fas、Cleaved Caspase-8及FADD在PPB作用于MCF-7細胞后顯著上調，而原型Caspase-8的蛋白表達顯著下調，表明睡茄內酯類化合物PPB還可通過誘導MCF-7細胞發生外源性凋亡來發揮抗乳腺癌作用。

綜上，PPB可以顯著抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖，且PPB對于正常的細胞毒性較小，其抗腫瘤作用機制與同時調控MCF-7細胞發生內、外源性凋亡有關。本課題組將進一步研究PPB抗乳腺癌的其他相關機制，為其抗腫瘤研究及未來的臨床應用提供更豐富的實驗依據。