雞屎藤苷酸對肝癌HepG2細胞炎癥因子水平、生長、凋亡、侵襲和血管生成的影響*

杜國明 ，吳濤 ，盧文士 ，劉作民 ，王貞儀

（1.鶴壁市人民醫院普外科，鶴壁 458030；2.新鄉醫學院第一附屬醫院普外科，衛輝 453100）

肝癌（HCC）是世界范圍內常見的侵襲型惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的第二大主要原因，具有復發高、轉移快的特點。早期肝癌患者的5年生存率可達60%～80%[1]，但不幸的是，大多數患者在確診時已處于晚期，導致肝癌的病死率高，預后效果差，5年生存率甚至不到20%[2]。傳統化學治療、放射治療在一定程度上改善患者的臨床預后，但其不良反應不容忽視。因此，尋求安全有效的藥物對提高預后效果，改善患者生存質量具有重要意義。

雞屎藤又名雞矢藤，具有疏肝和胃、活血止痛的功效。研究發現，雞屎藤顆粒可以抑制TGF-β1/Smad7途徑，抑制大鼠的肝纖維化[3]。一般認為，其環烯醚萜苷類為主要活性成分，包括雞屎藤苷酸[4]。雞屎藤苷酸具有鎮痛、抗炎、抗驚厥[5]、抗腫瘤[6]等藥理活性。雞屎藤抑制的TGF-β1/Smad7途徑是某些抗肝癌進展和轉移藥的靶標[7]，而且同時可能用于癌痛[8]，是有希望的抗肝癌前藥，但雞屎藤苷酸對肝癌的作用未見報道。本研究旨在體外實驗探討雞屎藤苷酸對肝癌細胞HepG2炎癥因子水平、生長、凋亡、侵襲和血管生成的影響，從腫瘤侵襲遷移的角度對肝癌的治療及預后提供實驗參考。

1 材料

1.1 細胞 人肝正常細胞系LO2、人肝癌細胞系SMC-7721、BEL7402、HepG2、 臍 靜 脈 內 皮 細 胞HUVEC均購自中國科學院細胞庫。

1.2 試劑 雞屎藤苷酸（paederosidic acid，PA，分子量：464.44，純度≥98%），成都普菲德科技有限公司；鹽酸厄洛替尼（Erlotinib hydrochloride，純度≥98%），美國Sigma-Aldrich公司。1%青-鏈霉素溶液、10%胎牛血清、DMEM培養基，美國Gibco公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；人γ干擾素（IFN-γ）試劑盒、白細胞介素-6（IL-6）試劑盒、白細胞介素-10（IL-10）試劑盒，上海江萊生物科技有限公司；B細胞淋巴 2（Bcl2）、Bcl2 相關 X（Bax）、裂解型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cleaved Caspase-3）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）、波形蛋白（Vimentin）、纖維黏連蛋白（FN）、E-鈣黏蛋白（E-cad）、血管內皮生長因子（VEGF）等相關抗體，美國Thermo Fisher公司。

1.3 儀器 MR-96A酶標儀，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；FACS Calibur流式細胞儀，美國BD公司；JC-CHP-80S CO2培養箱，青島聚創環保集團有限公司；Transwell小室，美國康寧公司；CR22N21N高速冷凍離心機，日本日立Himac公司；ZF-288全自動凝膠成像儀，上海金鵬分析儀器有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養 將凍存的細胞水浴融化后，接種于含有1%青-鏈霉素溶液、10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃、5% CO2培養箱中培養，每48 h更換培養基，待細胞鋪滿瓶底達80%以上，用于后續實驗。HUVEC細胞培養條件相同。

2.2 CCK8法檢測細胞活力 稀釋細胞密度為1×104個/mL，接種至 96 孔板，每孔 100 μL。24 h 后分別更換為100 μL含有不同濃度的雞屎藤苷酸溶液（0、1.25、2.5、5、10、20、40、160 和 320 μg/mL）的培養基，每濃度組設置6個復孔，培養24或48 h后，加入10 μL的CCK8試劑，1 h后，在酶標儀450 nm波長處讀取吸光度值OD，計算細胞的相對活力，篩選合適劑量。

2.3 流式檢測細胞凋亡 取對數生長期的肝癌細胞HepG2，消化、稀釋后，加入2.2篩選的合適劑量的雞屎藤苷酸溶液（20 μg/mL 和 40 μg/mL），每組設置6個復孔厄洛替尼（0.86 ng/mL）作為陽性對照，培養48 h后，用PBS溶液洗滌，胰酶消化使細胞懸浮，培養基終止消化，800 rpm/min離心5 min，離心半徑為13.5 cm，棄上清后，用1×Binding Buffer緩沖液稀釋成1×107個/mL的細胞懸液，取100 μL細胞懸液，按照試劑盒說明，將5μL標記FITC的AnnexinV與5 μL PI染液混勻，避光孵育10 min后，洗去染色液，用流式細胞儀進行檢測。

2.4 ELISA檢測相關炎癥因子的含量 取對數生長期的肝癌細胞HepG2，消化、稀釋后，加入合適劑量的雞屎藤苷酸溶液，每組設置6個復孔，培養48 h后，將細胞懸浮于磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，反復凍融破壞細胞膜，離心收集上清，分別按照IFN-γ、IL-6、IL-10試劑盒說明進行操作。在波長為450 nm處檢測各組吸光度，計算IFN-γ、IL-6、IL-10含量。

2.5 Western blot 取對數生長期的肝癌細胞HepG2，消化、稀釋后，加入合適劑量的雞屎藤苷酸溶液，每組設置6個復孔，培養48 h后。用PBS溶液洗滌，加入裂解試劑收集裂解液，離心15 min，用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，10%SDS-PAGE膠分離蛋白后轉膜，用5%脫脂牛奶室溫孵育封閉蛋白2h。分別加入 Bax、Bcl2、Cleaved Caspase-3、Caspase-3、IL-6、IL-10、E-cad、Vimentin、FN 以及 VEGF 等的相應一抗，孵育完成后，室溫下，用1×TBST緩沖液清洗PVDF膜10 min，重復3次，二抗室溫孵育2 h，1×TBST再洗3次，將PVDF膜正面向上置于潔凈的玻璃板上，加入ECL工作液顯色。將玻璃置于全自動凝膠成像分析儀中進行曝光，統計灰度值并計算蛋白表達量。

2.6 Transwell檢測細胞侵襲 將Matrigel膠用PBS稀釋后，包被于Transwell小室底膜的上室面，在下室加入800 μL含10%血清的培養基，取不同濃度藥液處理肝癌細胞HepG2，調整密度為1×105，接種100 μL于上室，放入培養箱中24 h后，取出侵襲小室，用PBS沖洗培養基，將小室內層未穿過的細胞用濕潤的棉簽擦除。用預冷的4%多聚甲醛固定處理后，進行0.1%結晶紫溶液染色及顯微鏡觀察。

2.7 內皮細胞成管實驗檢測腫瘤小管的形成 取對數生長期的肝癌細胞HepG2，消化、稀釋后，根據分組加入合適劑量的雞屎藤苷酸或厄洛替尼溶液，培養48 h后，收集培養基，用于配制細胞密度為5×103個/mL的HUVEC細胞懸液，取0.5 mL HUVEC懸液接種于鋪設基質膠的48孔板，12 h后，采用普通光學顯微鏡進行管樣結構觀察和拍攝，并用圖像分析軟件IPP 6.1統計分析[9]。

2.8 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行數據分析，選擇單因素方差分析One-Way ANOVA，數據用均數±標準差（±s）表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 雞屎藤苷酸對肝癌細胞活力的影響 雞屎藤苷酸處理24 h，對肝正常細胞系LO-2影響較小，對肝癌細胞系SMC-7721，HepG2和BEL7402有不同程度的活力抑制，以HepG2最敏感（P<0.05，圖1）。不同時間對雞屎藤酸苷處理對其藥效影響較小，當溶液濃度小于20 μg/mL時，雞屎藤苷酸對肝癌細胞活力的抑制作用較小，不具有明顯差異。當濃度大于40 μg/mL時，雞屎藤苷酸對肝癌細胞活力的抑制作用明顯（P<0.05，圖1），且呈劑量依賴性抑制。實驗提示，雞屎藤苷酸抑制肝癌細胞HepG2生長。選擇空白對照、20 μg/mL、40 μg/mL 雞屎藤苷酸劑量及陽性對照厄洛替尼（0.86 ng/mL），進行后續實驗。

圖1 不同濃度雞屎藤苷酸對肝癌細胞系活力的影響

3.2 雞屎藤苷酸對肝癌細胞凋亡的影響 與雞屎藤苷酸0 μg/mL的對照組相比，20 μg/mL組凋亡細胞數差異無統計學意義，但40 μg/mL組的細胞凋亡率顯著升高（P<0.05，圖 2Ⅰ-Ⅱ），40 μg/mL 組 Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3/Caspase-3也升高（P<0.05，圖2Ⅲ-Ⅴ）。實驗提示雞屎藤苷酸促進肝癌細胞HepG2凋亡。

圖2 雞屎藤苷酸對肝癌細胞HepG2凋亡的影響

3.3 雞屎藤苷酸對肝癌細胞侵襲的影響 與空白對照組相比，20 μg/mL組侵襲細胞數差異無統計學意義，染色細胞數目減少，40 μg/mL組侵襲細胞的數量明顯減少（P<0.05，圖3），實驗提示雞屎藤苷酸抑制肝癌細胞的侵襲。

圖3 雞屎藤苷酸對肝癌細胞侵襲的影響

3.4 雞屎藤苷酸對肝癌血管形成的影響 與空白對照組相比，20 μg/mL組VEGF表達差異無統計學意義，40 μg/mL組HepG2 VEGF的表達明顯下調（P<0.05，圖 4I）。小管形成實驗表明，20 μg/mL組與空白對照組差異不明顯，40 μg/mL組小管形成數明顯減少，管腔不完整（P<0.05，圖4Ⅰ-Ⅱ），實驗提示雞屎藤苷酸下調肝癌細胞HepG2血管內皮因子的表達并抑制腫瘤血管的形成。

圖4 雞屎藤苷酸對小管形成的影響

3.5 雞屎藤苷酸對肝癌細胞炎癥因子含量的影響 與空白對照組相比，20 μg/mL組差異無統計學意義，40 μg/mL 組 IFN-γ、IL-6的含量明顯下降，IL-10的含量明顯升高（P<0.05，圖5），實驗提示雞屎藤苷酸抑制促炎因子合成、促進抗炎因子釋放，緩解炎癥的程度。

圖5 雞屎藤苷酸對肝癌細胞炎癥因子含量的影響

3.6 雞屎藤苷酸對肝癌細胞炎癥因子表達的影響 與空白對照組相比，20 μg/mL組差異無統計學意義，40 μg/mL組IL-6的表達明顯下調，IL-10的表達明顯上調（P<0.05，圖6），實驗提示雞屎藤苷酸調節肝癌細胞內炎癥因子表達，減少了炎癥反應與細胞免疫反應，緩解肝癌的發生發展，與3.5的結果吻合。

圖6 雞屎藤苷酸對肝癌細胞炎癥因子表達的影響

3.7 雞屎藤苷酸對肝癌細胞侵襲相關蛋白表達的影響 與空白對照組相比，20 μg/mL組差異無統計學意義，40 μg/mL 組波形蛋白（Vimentin）、纖維粘連蛋白（FN）的表達明顯下調，E-鈣黏蛋白（E-cad）的表達明顯上調（t=19.107、12.544、7.703，P<0.05，圖 7），實驗提示雞屎藤苷酸抑制肝癌細胞的侵襲，與3.3的結果吻合。

圖7 雞屎藤苷酸對肝癌細胞侵襲相關蛋白表達的影響

4 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，對于肝癌的預防及治療仍是世界面臨的巨大挑戰，其發生發展與復雜的機制相關。大量研究表明，持續的炎癥是促進和加重惡性腫瘤程度的重要原因[10]。

肝癌是典型的炎癥驅動型腫瘤，在早期炎癥激活纖維化，最終導致肝硬化和肝癌的發生；在腫瘤階段，肝實質細胞死亡和由此引起的炎癥級聯激活的傷口愈合反應持續存在[10]。因此，抗炎尤其是腫瘤微環境的炎癥，對于肝癌的治療來說，可能有特別重要的意義。白細胞介素-6（IL-6）、人γ干擾素（IFN-γ）等促炎因子積極參與和調節腫瘤細胞的發生發展[11]，白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-10（IL-10）等抗炎因子，具有免疫抑制作用，緩解炎癥的發生，從而減少腫瘤的發生和轉移。實驗結果顯示，IFN-γ、IL-6的含量明顯下降，IL-10的含量明顯升高，提示雞屎藤苷酸抑制促炎因子合成、促進抗炎因子釋放，緩解炎癥的程度。

細胞凋亡（apoptosis）是指為維持內環境穩定，細胞進行有序的自主死亡。但當細胞的凋亡機制受到抑制，不能進行正常的細胞死亡清除時，導致癌變的發生。因此，促進腫瘤細胞的凋亡，能夠有效抑制惡性轉化，緩解癌癥的進程。比如，Liu等[12]的研究顯示，苦豆堿通過PI3K/Akt信號通路誘導肝癌細胞凋亡和G2/M細胞周期阻滯，具有抗腫瘤潛力；Chen等[13]的研究表明，氟西汀通過誘導腫瘤細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用。本實驗結果顯示，細胞凋亡率顯著升高，Bax/Bcl-2與Cleaved Caspase-3/Caspase-3升高，與上述研究一致，實驗提示，雞屎藤苷酸促進肝癌細胞HepG2凋亡。

纖維粘連蛋白（FN）是細胞外基質中重要的細胞黏附分子，而腫瘤細胞黏附能力的改變被視作腫瘤細胞侵襲和轉移的起始[14]。此外，上皮間質轉化（EMT）是調控腫瘤細胞侵襲和轉移的機制之一，上皮標志物E-鈣黏蛋白（E-cad）的減少和間質標志物波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-Cad）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）等的增加，使細胞緊密連接、極性丟失和間充質細胞形態轉變，導致腫瘤細胞粘附作用減弱而運動能力增強，從而獲得更強的遷移和侵襲能力[15]。因此，芍藥苷[16]在增加E-cad表達后，對HepG2生長有抑制作用，能顯著降低肝癌細胞株的侵襲、轉移和黏附。本實驗結果顯示，侵襲細胞的數量明顯減少，波形蛋白（Vimentin）、纖維粘連蛋白（FN）的表達明顯下調，E-鈣黏蛋白（E-cad）的表達明顯上調，與上述研究一致，實驗提示雞屎藤苷酸抑制肝癌細胞的侵襲與轉移。

肝癌是高度血管化的惡性疾病，血管生成對癌細胞的生長、侵襲、轉移等至關重要[17]。其中，血管內皮生長因子（VEGF）是調節腫瘤血管生成的重要調控因素，據文獻報道，VEGF在肝癌組織和細胞內呈現異常表達[18-19]。因此，抑制VEGF的表達是緩解腫瘤的發生發展的重要思路。本實驗檢測了小管形成，以反映HepG2細胞分泌細胞因子對內皮細胞血管形成能力的促進。結果顯示：雞屎藤苷酸處理導致VEGF表達下調，處理后的培養液使小管形成數明顯減少，與上述研究一致。提示雞屎藤苷酸通過降低VEGF表達，減少腫瘤血管生成，抑制肝癌細胞生長、侵襲、轉移，具有良好的抗腫瘤潛力。

在肝癌中，炎癥、血管內皮細胞紊亂、細胞外基質和腫瘤微環境的改變等上述機制相互促進，共同導致腫瘤的進展[20]。雞屎藤苷酸對肝纖維化的TGF-β抑制機制[3]，被報道是某些抗肝癌藥物的靶標[7]，發現其在雞屎藤酸苷處理的HepG2中也被抑制。同時雞屎藤苷酸可以直接導致HepG2細胞的凋亡，也能抑制腫瘤的管形成，降低炎癥因子水平，并調控侵襲相關蛋白以抑制侵襲。因此，雞屎藤苷酸抗肝癌作用可能是多方面的。

綜上，雞屎藤苷酸調節炎癥因子水平，抑制肝癌細胞HepG2生長、侵襲、血管形成并促進其凋亡，緩解腫瘤的發生發展，具有治療肝癌的潛力及深入研究的意義。