Netrin-1、Slit2在夾脊電針結合神經(jīng)松動術調(diào)節(jié)兔坐骨神經(jīng)損傷后Rho GTPases失衡的作用

張立，吳珊紅，趙樂樂，王艷

1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱市 150040；3.浙江省中醫(yī)院，浙江杭州市 310003

0 引言

周圍神經(jīng)連接中樞神經(jīng)與靶器官，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同的是，周圍神經(jīng)損傷后可自主再生修復[1]，但該過程受細胞內(nèi)外微環(huán)境的影響，故調(diào)節(jié)介導神經(jīng)再生的相關因子，對于周圍神經(jīng)損傷后軸突的再生修復具有重要意義[2-3]。

Netrin-1 和Slit2 為神經(jīng)生長導向因子的代表，其中Netrin-1 為神經(jīng)生長吸引性信號分子，Slit2 為神經(jīng)生長排斥性信號分子[4-5]，二者分別與其受體DCC 和Robo 結合發(fā)揮作用，共同促進受損神經(jīng)功能的恢復[6]。Rho GTPases酶系統(tǒng)代表分子有Rac1、Cdc42 和RhoA。Rac1、Cdc42 促進神經(jīng)軸突再生[7]，RhoA 抑制神經(jīng)元生長遷移[8-9]。周圍神經(jīng)損傷后一段時間Netrin-1 和Slit2 保持高表達，而Rac1、Cdc42 表達降低，RhoA 表達升高。因此，我們推斷夾脊電針結合神經(jīng)松動術對周圍神經(jīng)損傷的治療作用可能是通過調(diào)控Netrin-1、Slit2 的表達進而調(diào)節(jié)Rho GTPases酶系統(tǒng)平衡實現(xiàn)的。前期實驗證實，夾脊電針結合神經(jīng)松動術可上調(diào)Netrin-1 和Slit2 的表達，調(diào)控Rho GTPases 酶系統(tǒng)平衡，促進神經(jīng)再生[10-11]，但其作用的通路還需進一步探討。因此，本實驗構建Netrin-1、Slit2 腺病毒進一步驗證Netrin-1、Slit2 在夾脊電針結合神經(jīng)松動術調(diào)節(jié)兔坐骨神經(jīng)損傷后Rho GTPases 失衡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取新西蘭家兔216 只，7～8 月齡，雌雄各半，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由沈陽生物萬類有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(津)2016-0001。單籠飼養(yǎng)，自然光照，室溫22～25 ℃。隨機數(shù)字表法分為正常對照組、病毒空載組、夾脊電針結合神經(jīng)松動術組、Netrin-1 組、Slit2 組和Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組，按術后1、2、4 周3 個時間點分為3 個亞組，每個亞組12 只。實驗過程均遵守國家關于善待動物的相關規(guī)定。

本實驗由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 主要儀器及試劑

超純水系統(tǒng)：香港HEAL 公司。超速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。微量移液器：蘇州BIOHIT公司。真空干燥箱：上海SYSBERY公司。紫外分光光度計：美國THERMO 公司。熒光定量PCR 儀：韓國BIONEER 公司。水平搖床、電泳儀、轉(zhuǎn)移槽、雙垂直蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)：北京六一生物科技有限公司。酶標儀：美國BIOTEK 公司。電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津泰斯特公司。

全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、一抗二抗去除液、SDS-PAGE 電泳液、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、ECL發(fā)光液、Racl抗體、Cdc42抗體、RhoA 抗體、羊抗兔IgG-HRP、內(nèi)參抗體β-action：萬類生物科技有限公司。預染蛋白分子量標準：加拿大FERMENTAS公司。

1.3 模型制備

家兔(除正常對照組)稱重標號，麻醉采用肌注速眠新0.2 mL/kg，腹腔注射10%水合氯醛2 mL/kg，結合耳緣靜脈注射10%水合氯醛(劑量不超過2 mL)。待兔麻醉后，于左股部手術區(qū)域常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，股正中切口，長2 cm，游離并暴露坐骨神經(jīng)股部。將止血鉗的頭端套輸液管套，垂直深入，全齒夾神經(jīng)干，時長5 min，損傷2 mm。將無菌塑料導管剪成的圓片于神經(jīng)損傷平肌肉處固定作為標記。坐骨神經(jīng)損傷模型由同一個人、同手法制備。

模型制備成功標準如下。①鏡下觀察：軸索、髓鞘、內(nèi)膜斷裂，神經(jīng)束膜完整，符合Sunderland Ⅲ度損傷。②行為學觀察：兔移動時身體重心右移，左側(cè)髖部下降，左側(cè)足下垂、拖地。

1.4 干預方法

正常對照組：無任何處理。

病毒空載組[12-13]：于模型制備時進行空載病毒注射。分別于神經(jīng)損傷處上3 mm、下3 mm 各注射5 μL。微量注射器針頭斜面朝上，切入神經(jīng)外膜(切勿損傷神經(jīng)內(nèi)膜)，深度2 mm。針頭穩(wěn)定后，將其旋轉(zhuǎn)使針頭切面朝下，緩推活塞，將病毒緩慢注入神經(jīng)外膜下，可見光鏡下有白色小泡鼓起。待病毒注射完成，緩慢將注射器拔出，逐層縫合。

夾脊電針結合神經(jīng)松動術組：術后3 d 治療，先行夾脊電針治療，繼神經(jīng)松動術治療。夾脊電針操作：家兔俯臥位固定，以直徑0.25 mm、長25 mm 針灸針于兔L4-6脊髓節(jié)段對應椎體棘突旁0.5～1 寸內(nèi)進行直刺，深度1 cm，每側(cè)3 針，于脊柱兩側(cè)的針柄上連接電針儀。波形為疏密波，頻率2 Hz/100 Hz，強度以家兔背部針柄顫動為度，每次30 min，每天1 次，每周6 d。神經(jīng)松動術操作：家兔俯臥位固定，左下肢于治療臺外懸空，起始姿勢為髖關節(jié)前屈45°固定，脛骨與股骨夾角30°；沿坐骨神經(jīng)走向，迅速將左膝關節(jié)伸展至130°，之后放松還原至起始位置。每次操作拉伸1 s，放松5 s，每天10次，每周6 d。

Netrin-1組：于制備模型時，注射Netrin-1腺病毒(滴度為1.2×108個病毒顆粒/mL)，具體操作方法與病毒空載組一致。

Slit2 組：于制備模型時，注射Slit2 腺病毒(滴度為1.6×108個病毒顆粒/mL)，具體操作方法與病毒空載組一致。

Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組：于模型制備時，注射Netrin-1 腺病毒、Slit2 腺病毒，操作方法與病毒空載組一致。

實驗所需的Netrin-1 和Slit2 腺病毒的包裝、純化和滴度測定均由上海吉凱基因化學技術有限公司完成。

1.5 動物取材

術后1、2、4 周治療結束后，取各組家兔坐骨神經(jīng)(卡壓處為中心，長度約2 cm)和L4-6脊髓節(jié)段(長度約3 cm 的組織)。坐骨神經(jīng)：清潔無菌條件下，剪開兔皮膚、筋膜、肌肉，將坐骨神經(jīng)暴露，以卡壓點為中心，取2 cm神經(jīng)組織。手術刀片將神經(jīng)組織縱向切開，一半放入液氮中速凍，繼而存入-80 ℃冰箱，一半放入4%多聚甲醛溶液中固定，以待檢測。脊髓：家兔背部剃毛、備皮、消毒，以L4-6脊髓節(jié)段對應椎骨為中心做縱形切口，用剪骨鉗取出目標椎骨節(jié)段，剔除周圍肌肉、軟組織及椎板，取出脊髓組織。以實驗刀片將脊髓組織縱向分離，一半放入液氮中速凍，繼而存入-80 ℃冰箱，一半放入4%多聚甲醛溶液中固定，以待檢測。

1.6 檢測指標

1.6.1 坐骨神經(jīng)神經(jīng)傳導速度檢測

家兔于術后第1、2、4 周，在屏蔽肌電圖室內(nèi)，于取材前，在體檢測神經(jīng)傳導速度。游離損傷坐骨神經(jīng)，以鉤狀電極刺激坐骨神經(jīng)損傷部位的近遠端神經(jīng)干。記錄刺激兩點之間的潛伏期及兩點距離。

1.6.2 熒光實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)檢測Netrin-1、Slit2基因表達

取出預先凍存于-80 ℃冰箱內(nèi)的坐骨神經(jīng)及脊髓組織。用TRIpure 試劑裂解樣本，提取樣本總RNA，將所得到的RNA 樣本反轉(zhuǎn)錄得到對應cDNA，將cDNA、上下游引物、SYBR GREEN mastermix、ddH2O進行反應，采用Exicycler TM 96 熒光定量儀(韓國BIONEER公司)進行熒光定量分析。

引物序列如下。

Netrin-1：上游5'-GCA GAA CGA ACA GGA GGC A-3'；下游5'-TCG GAC ACG GCG TAG AAG-3'

Slit2：上游5'-TAA TCC CTG CTT ATC CAA-3'；下游：5'-TGT TTA CAC GGG TTA CTG A-3'

β-actin：上游5'-CCA GGT CAT CAC CAT CGG-3'；下游5'-TGT CCA CGT CGC ACT TCA-3'

1.6.3 Western blotting

取出預先凍存于-80 ℃冰箱內(nèi)坐骨神經(jīng)及脊髓組織。用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA 反應測定蛋白濃度，制備上樣液。等量蛋白，經(jīng)相應濃度SDSPAGE 分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜(美國MILLIPORE 公司)。滴入相應一抗、二抗進行免疫反應。ECL 發(fā)光液底物顯影。掃描膠片，凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶相對光密度值。各組目的蛋白與對照組蛋白的光密度比表示相對表達量。

1.6.4 免疫熒光雙染檢測Netrin-1、Slit2蛋白定位

取出預先固定于4%多聚甲醛溶液中的組織，脫水、透蠟、包埋，使其形成堅硬的蠟塊。將蠟塊切成厚5 μm 的薄片，先后放入99%二甲苯、乙醇(濃度梯度依次為95%，85%，75%)、PBS 中浸泡，滴山羊血清，依次加入相應一抗、二抗進行免疫反應。滴DAP復染核，PBS 浸泡，膠頭滴管滴加抗熒光淬滅劑，蓋玻片封片。熒光顯微鏡下觀察染色效果，并在400×鏡下拍照。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布，以() 表示，采用ANOVA 方差分析，LSD Post-Hoc test 進行事后兩兩比較；若不符合正態(tài)分布，多組間比較采用秩和Kruskal-Wallis檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 坐骨神經(jīng)傳導速度

術后1、2、4 周同時間點，病毒空載組及各治療組神經(jīng)傳導速度均低于正常對照組(P＜0.05)；夾脊電針結合神經(jīng)松動術組、Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組神經(jīng)傳導速度高于Netrin-1 組、Slit2 組(P＜0.05)；夾脊電針結合神經(jīng)松動術組與Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組比較無顯著性差異(P＞0.05)；Netrin-1 組與Slit2 組比較無顯著性差異(P＞0.05)。術后1 周時，病毒空載組神經(jīng)傳導速度高于其他治療組(P＜0.05)；術后2、4周，病毒空載組低于其他治療組(P＜0.05)。除正常對照組和病毒空載組，其余各治療組神經(jīng)傳導速度均在術后4周時最快。見表1。

表1 各組術后1、2、4周坐骨神經(jīng)傳導速度比較 單位：m·s-1

2.2 Netrin-1、Slit2 基因表達

2.2.1 Netrin-1

術后1、2、4 周同時間點，在坐骨神經(jīng)及脊髓節(jié)段中，病毒空載組、夾脊電針結合神經(jīng)松動術組、Netrin-1 組、Slit2 組和Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組的Netrin-1 mRNA表達均高于正常對照組(P＜0.05)；Netrin-1 組和Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組Netrin-1 mRNA表達高于病毒空載組和Slit2組(P＜0.05)；病毒空載組與Slit2 組間比較無顯著性差異(P＞0.05)；Netrin-1 組與Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組比較無顯著性差異(P＞0.05)；夾脊電針結合神經(jīng)松動術組、Netrin-1組和Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組趨勢一致，且均高于病毒空載組(P＜0.05)；Netrin-1 mRNA 的表達隨時間推移逐漸上調(diào)，以4周表達最佳。見表2、表3。

表2 各組術后1、2、4周坐骨神經(jīng)Netrin-1 mRNA表達

表3 各組術后1、2、4周脊髓節(jié)段Netrin-1 mRNA表達

2.2.2 Slit2

術后1、2、4 周同時間點，在坐骨神經(jīng)和脊髓節(jié)段中，病毒空載組、夾脊電針結合神經(jīng)松動術組、Netrin-1 組、Slit2 組和Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組Slit2 mRNA表達均高于正常對照組(P＜0.05)；Slit2組和Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組Slit2 mRNA 表達高于病毒空載組和Netrin-1 組(P＜0.05)；病毒空載組與Netrin-1 組間、Slit2 組與Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組間比較無顯著性差異(P＞0.05)；夾脊電針結合神經(jīng)松動術組與Slit2組、Netrin-1+Slit2腺病毒結合組趨勢一致，且均高于病毒空載組(P＜0.05)；Slit2 mRNA的表達隨時間推移逐漸上調(diào)，以4 周表達最佳。見表4、表5。

表4 各組術后1、2、4周坐骨神經(jīng)Slit2 mRNA表達

表5 各組術后1、2、4周脊髓節(jié)段Slit2 mRNA表達

2.3 Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達

2.3.1 Rac1

術后1、2、4 周同時間點，在坐骨神經(jīng)和脊髓節(jié)段中，病毒空載組、夾脊電針結合神經(jīng)松動術組、Netrin-1 組、Slit2 組和Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組Rac1表達均低于正常對照組(P＜0.05)；夾脊電針結合神經(jīng)松動術組、Netrin-1+Slit2腺病毒結合組Rac1表達高于病毒空載組、Netrin-1組和Slit2組(P＜0.05)；Netrin-1 組Rac1 表達高于病毒空載組和Slit2 組(P＜0.05)；病毒空載組和Slit2 組比較無顯著性差異(P＞0.05)。在坐骨神經(jīng)中，術后1 周，夾脊電針結合神經(jīng)松動術組Rac1 表達高于Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組(P＜0.05)。在脊髓節(jié)段中，術后1、4 周，夾脊電針結合神經(jīng)松動術組Rac1 表達高于Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組(P＜0.05)。見表6、表7。

表6 各組術后1、2、4周坐骨神經(jīng)Rac1蛋白表達

表7 各組術后1、2、4周脊髓節(jié)段Rac1蛋白表達

2.3.2 Cdc42

術后1、2、4 周同時間點，在坐骨神經(jīng)和脊髓節(jié)段中，病毒空載組、夾脊電針結合神經(jīng)松動術組、Netrin-1 組、Slit2 組和Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組Cdc42 表達均低于正常對照組(P＜0.05)；夾脊電針結合神經(jīng)松動術組、Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組Cdc42表達高于病毒空載組、Netrin-1組和Slit2組(P＜0.05)；Netrin-1 組Cdc42 表達高于病毒空載組和Slit2 組(P＜0.05)；病毒空載組與Slit2 組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。在坐骨神經(jīng)中，術后1 周，夾脊電針結合神經(jīng)松動術組高于Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組(P＜0.05)；術后2、4周，Netrin-1+Slit2腺病毒結合組高于夾脊電針結合神經(jīng)松動術組(P＜0.05)。在脊髓節(jié)段中，術后1、4 周，夾脊電針結合神經(jīng)松動術組高于Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組(P＜0.05)；術后2 周，Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組高于夾脊電針結合神經(jīng)松動術組(P＜0.05)。見表8、表9。

表8 各組術后1、2、4周坐骨神經(jīng)Cdc42蛋白表達

表9 各組術后1、2、4周脊髓節(jié)段Cdc42蛋白表達

2.3.3 RhoA

術后1、2、4 周同時間點，在坐骨神經(jīng)和脊髓節(jié)段中，病毒空載組、夾脊電針結合神經(jīng)松動術組、Netrin-1 組、Slit2 組和Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組RhoA 表達均高于正常對照組(P＜0.05)；夾脊電針結合神經(jīng)松動術組、Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組RhoA表達低于病毒空載組、Netrin-1組、Slit2組(P＜0.05)；Slit2 組RhoA 表達低于病毒空載組、Netrin-1 組(P＜0.05)；病毒空載組、Netrin-1 組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。術后1、4周，Netrin-1+Slit2腺病毒結合組RhoA 表達低于夾脊電針結合神經(jīng)松動術組(P＜0.05)；術后2 周，夾脊電針結合神經(jīng)松動術組低于Netrin-1+Slit2腺病毒結合組(P＜0.05)。見表10、表11。

表10 各組術后1、2、4周坐骨神經(jīng)RhoA蛋白表達

表11 各組術后1、2、4周脊髓節(jié)段RhoA蛋白表達

2.4 Netrin-1、Slit2 蛋白定位

2.4.1 坐骨神經(jīng)

Netrin-1、Slit2 蛋白定位與PCR 表達結果趨勢一致。見圖1～圖3。

圖1 術后1周坐骨神經(jīng)Netrin-1、Slit2蛋白定位(免疫熒光雙染，×400)

圖2 術后2周坐骨神經(jīng)Netrin-1、Slit2蛋白定位(免疫熒光雙染，×400)

圖3 術后4周時坐骨神經(jīng)Netrin-1、Slit2 蛋白定位(免疫熒光雙染，×400)

2.4.2 脊髓節(jié)段

Netrin-1、Slit2 蛋白定位與PCR 表達結果趨勢一致。見圖4～圖6。

圖4 術后1周脊髓組織Netrin-1、Slit2 蛋白定位(免疫熒光雙染，×400)

圖5 術后2周脊髓組織Netrin-1、Slit2 蛋白定位(免疫熒光雙染，×400)

圖6 術后4周脊髓組織中Netrin-1、Slit2蛋白定位(免疫熒光雙染，×400)

3 討論

周圍神經(jīng)損傷后，細胞內(nèi)微環(huán)境中相關吸引及排斥因子引導生長錐延伸；軸突生長方向?qū)p傷神經(jīng)的修復再生起到重要的作用。Netrin-1 和Slit2 作為神經(jīng)導向因子，對于軸突再生、細胞骨架重排的調(diào)控作用是通過與其相應的受體DCC、Robo2 結合后，調(diào)控Rho GTPases 酶系統(tǒng)實現(xiàn)的。Rho 作為細胞內(nèi)外信號傳遞的關鍵因子，可介導神經(jīng)軸突、樹突的生長，分支及導向[14]。其中Rac1、Cdc42 受吸引性信號分子Netrin-1 調(diào)控，Rac1 引導神經(jīng)元遷移、增殖和存活，促進軸突生長[15]，Cdc42 促進絲狀偽足細胞突起、塑造細胞形態(tài)、誘導細胞遷移生長[16]。而RhoA 受排斥性信號分子Slit2 調(diào)控，過度激活RhoA，會引起生長錐塌陷，致使軸突再生障礙[17]。有研究指出[18-21]，Netrin-1 與受體DCC 結合，激活下游Rho 鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide-exchange factor,GEFs)，促進GDP 轉(zhuǎn)化為GTP，使Rho GTPases 酶系統(tǒng)活化，選擇性調(diào)節(jié)下游因子Rac1、Cdc42，從而誘導細胞骨架重排、引導生長錐朝向、轉(zhuǎn)向運動及遷移，促進軸突穩(wěn)定再生，介導周圍神經(jīng)再生修復。胞外Slit2分子與受體Robo2 結合后，激活GAP 家族中的slit-robo GTPases 酶激活蛋白(srGAP)，srGAP 與Robo2 的胞內(nèi)域CC3 結合后使GAP 構型產(chǎn)生改變，從而將胞外信息傳至細胞核，激活Rho GTPases 信號系統(tǒng)，細胞根據(jù)傳入信息進行相應的轉(zhuǎn)錄翻譯，介導RhoA 表達，并將信號傳導至遠端的生長錐，重新排列細胞骨架。由此可見，Netrin-1、Slit2 這對導向分子的吸引、排斥共同作用，整合調(diào)整再生軸突的投射軌跡，通過Rho GTPase的開關效應，將導向信號傳遞至生長錐中的細胞骨架，致細胞骨架重組并不斷選擇和修正方向與靶器官建立精確聯(lián)系。周圍神經(jīng)損傷后Rac1、Cdc42 表達降低，RhoA 表達升高，Rho GTPases 酶系統(tǒng)表現(xiàn)失衡狀態(tài)[22-23]。因此，我們推測在周圍神經(jīng)損傷的治療中可通過作用Netrin-1、Slit2，從而上調(diào)Rac1、Cdc42 表達，下調(diào)RhoA 表達，促進損傷神經(jīng)的軸突再生及結構功能的恢復。

前期研究顯示，夾脊電針結合神經(jīng)松動術可上調(diào)Netrin-1 和Slit2 及其相應受體DCC 和Robo2 的表達，促進損傷后周圍神經(jīng)再生[10,24]；夾脊電針結合神經(jīng)松動術可糾正Rho GTPases 酶系統(tǒng)不平衡，促進神經(jīng)軸突再生[11,25-26]。可見夾脊電針結合神經(jīng)松動術對周圍神經(jīng)損傷再生恢復效果較好[27-30]。因此，本研究通過Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組模擬夾脊電針結合神經(jīng)松動術在坐骨神經(jīng)損傷后上調(diào)Netrin-1和Slit2表達的現(xiàn)象，進一步闡述Netrin-1、Slit2 在夾脊電針結合神經(jīng)松動術治療后對兔坐骨神經(jīng)損傷Rho GTPases 失衡的調(diào)節(jié)機制。本研究顯示，夾脊電針結合神經(jīng)松動術可顯著改善兔坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)傳導速度，促進神經(jīng)功能的恢復，且各組均在術后4 周最佳。病毒空載組在1周時神經(jīng)傳導速度高于其他治療組，可能是周圍神經(jīng)損傷后發(fā)生Wallerian 變性，在1 周時神經(jīng)壞死不完全，在沒有任何介入治療的情況下，Wallerian 變性的時間段可能更長；在術后1、2、4 周同時間點，夾脊電針結合神經(jīng)松動術組的Netrin-1 和Slit2 均有表達，且術后4 周達高峰，Netrin-1 組、Slit2 組、Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組在注射病毒之后均出現(xiàn)相應目的基因的表達，且表達趨勢與夾脊電針結合神經(jīng)松動術組一致，可知周圍神經(jīng)損傷后夾脊電針結合神經(jīng)松動術療法可上調(diào)軸突導向因子Netrin-1 及Slit2 共同表達，促進受損神經(jīng)功能恢復，與課題組前期研究結果一致；術后1、2、4 周同時間點，病毒空載組對目的基因調(diào)控性差，因此可以排除病毒對于目的基因表達的影響，Netrin-1 組和Slit2 組對于Rho GTPases 酶系統(tǒng)的調(diào)控優(yōu)于病毒空載組，但低于夾脊電針結合神經(jīng)松動術組、Netrin-1+Slit2 腺病毒組，說明單獨Netrin-1或Slit2 均可調(diào)控Rho GTPases 酶系統(tǒng)的失衡，兩者結合調(diào)控更強。

夾脊電針結合神經(jīng)松動術可促進周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)導向因子Netrin-1 和Slit2 的表達，同時能夠調(diào)控失衡的Rho GTPases 酶系統(tǒng)，使該系統(tǒng)趨于平衡。此外，Netrin-1+Slit2 腺病毒結合組調(diào)控Netrin-1 蛋白和Slit2 蛋白表達后也會引起Rho GTPases 酶系統(tǒng)向平衡狀態(tài)發(fā)展，與夾脊電針結合神經(jīng)松動術組表達趨勢相同。因此，課題組認為夾脊電針結合神經(jīng)松動術促進周圍神經(jīng)損傷再生的作用機制可能是由Netrin-1、Slit2/Rho GTPases 酶系統(tǒng)信號通路介導。最后，本實驗由于其他不可抗因素，選擇的時間點相對較少，可能忽視神經(jīng)損傷后的即刻反應，后期實驗將進一步細化。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。