不同紅豆杉屬植物中7種紫杉烷類化合物的HPLC檢測(cè)與分析

崔海超, 鄭文藝，張智慧，傅岳峰，李欣悅，付玉杰,2，顧成波*

(1.東北林業(yè)大學(xué) 森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 林業(yè)生物制劑教育部工程研究中心，黑龍江省林源活性物質(zhì)生態(tài)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 哈爾濱 150040； 2.北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北京 100083)

0 引言

紅豆杉屬植物為常綠喬木或灌木，全世界有11種。我國(guó)有4種和1個(gè)變種，分別是中國(guó)紅豆杉(Taxuschinensis)、云南紅豆杉(Taxusyunnanensis)、西藏紅豆杉(Taxuswallichiana)、東北紅豆杉(Taxuscuspidata)、南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)(變種)。此外，還有引種我國(guó)的雜交品種曼地亞紅豆杉(Taxus×mediacv.hicksii)，其母本為東北紅豆杉，父本為歐洲紅豆杉(Taxusbaccata)[1]。

紅豆杉是我國(guó)的一級(jí)珍稀瀕危保護(hù)樹(shù)種，含有多種藥用成分。紅豆杉葉可以入藥，具有治療痛經(jīng)、利尿的功效，主治腎炎浮腫、小便不利和糖尿病等癥。紫杉醇(Paclitaxel)是從紅豆杉科紅豆杉屬植物中分離得到的一種四環(huán)二萜類生物堿，自1992 年美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市以來(lái)，已成為世界上公認(rèn)的抗癌用藥[2]。

紫杉烷類化合物是與紫杉醇合成代謝相關(guān)的二萜類化合物的總稱，目前從紅豆杉屬植物中分離出的紫杉烷類化合物已有500余種[3]。除了紫杉醇，三尖杉寧堿(Taxol B)、巴卡亭Ⅲ(Baccatin Ⅲ)、10-去乙?；涂ㄍ?10-DAB)、10-去乙?；仙即?10-DAT)、7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇(7-xyl-10-DAT)和7-表-10-去乙酰基紫杉醇(7-epi-10-DAT)也均是紫杉烷化合物。由于一些紫杉烷類化合物與紫杉醇的結(jié)構(gòu)相似，可作為紫杉烷類藥物的半合成原料，通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾改造成紫杉醇，甚至藥效更好的化合物，在抗癌藥物合成中具有重要應(yīng)用[4-5]。

紅豆杉屬植物中紫杉烷類成分含量極低，同時(shí)分析檢測(cè)多種紅豆杉中紫杉烷類化合物較困難。紅豆杉不同品種、不同年齡，甚至同一品種的不同提取部位，紫杉烷類化合物的含量均有明顯的差異[6-8]。為分析比較不同紅豆杉屬植物中紫杉烷類物質(zhì)含量的差異，本研究以3種紅豆杉屬植物(東北紅豆杉、南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉)為研究對(duì)象，在建立7種紫杉烷類化合物(紫杉醇、10-去乙酰基巴卡亭、三尖杉寧堿、巴卡亭Ⅲ、10-去乙?；仙即肌?-木糖-10-去乙?；仙即己?-表-10-去乙?；仙即?的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)3種紅豆屬植物中紫杉烷類化合物含量進(jìn)行了比較分析[9-13]，旨在為紅豆杉屬植物的質(zhì)量控制、種源選育、資源的保護(hù)與合理開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

東北紅豆杉、南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉主干樹(shù)皮樣品，來(lái)源于東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研溫室內(nèi)7年生盆栽苗。

標(biāo)準(zhǔn)品紫杉醇、三尖杉寧堿、巴卡亭Ⅲ、10-去乙?；仙即肌?0-去乙?；涂ㄍ?、7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇和7-表-10-去乙?；仙即紝?duì)照品(四川省維克奇生物科技有限公司)，純度均大于98%。色譜級(jí)乙腈大于等于99.9%(迪馬科技有限公司)，色譜級(jí)甲醇大于等于99.9%(迪馬科技有限公司)，分析純甲醇大于等于99.5%(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

1.2 儀器

Agilent Technologies 1290 infinityⅡ高效液相色譜(美國(guó)Agilent公司)，HiQsil C18色譜柱(日本KYATECH公司)，1290VWD紫外吸收檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)； AB104型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；RFA-02L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)。

1.3 色譜條件

色譜柱為 HiQsil C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-1%體積分?jǐn)?shù)乙酸水溶液和乙腈-1%體積分?jǐn)?shù)乙酸水溶液4種不同流動(dòng)相體系及4種不同檢測(cè)波長(zhǎng)(227、250、273、228 nm)下各紫杉烷類成分的色譜行為。根據(jù)基線分離效果，采用乙腈-水作為流動(dòng)相；梯度洗脫程序?yàn)椋?～10 min，30%乙腈；10～12 min，30%～45%乙腈；12～25 min，45%乙腈；25～30 min，42%～45%乙腈；30～40 min，30%～42%乙腈；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm(篩選了4種檢測(cè)波長(zhǎng)，最終確定227nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng))；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.4 對(duì)照品溶液制備

分別稱取7種紫杉烷類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%色譜級(jí)甲醇溶液溶解并將其定容到10 mL的容量瓶中，使樣品溶液均成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，置入-20 ℃待用。

1.5 供試品溶液的制備

參考文獻(xiàn)[10]的方法并稍做改動(dòng)，將東北紅豆杉、南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉主干樹(shù)皮洗凈，于60 ℃干燥后粉碎樣品。每種紅豆杉樣品取粉末1.0 g于50 mL的錐形瓶中，加入30 mL 80%乙醇，超聲提取30 min，過(guò)濾，重復(fù)此操作2次，收集3次樣品溶液濾液，合并3次濾液。濾液經(jīng)過(guò)濃縮后加入甲醇溶液溶解定容到一定體積，分離液加入等量等比例脫脂溶液(乙酸乙酯)脫脂，放置過(guò)夜，對(duì)其離心去上清液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，得到3份不同紅豆杉屬植物制得的樣品，各取2 mL不同樣品混合均勻，之后進(jìn)行紫杉烷類化合物的檢測(cè)。

1.6 線性關(guān)系及精密度、重現(xiàn)性試驗(yàn)

取7種紫杉烷類化合物的混合對(duì)照品溶液，使用100%甲醇逐級(jí)稀釋，按1.3確定的色譜條件檢測(cè)，根據(jù)上述的對(duì)照品質(zhì)量濃度及測(cè)定的峰面積分別繪制出各紫杉烷類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，每條標(biāo)準(zhǔn)曲線由6個(gè)不同質(zhì)量濃度組成，峰面積為3次重復(fù)進(jìn)樣測(cè)得的平均值。

取7種混合對(duì)照品溶液，按1.3確定的色譜條件，分別將同一對(duì)照品溶液重復(fù)測(cè)定6次，分析每次測(cè)定的對(duì)照品的保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察檢測(cè)方法的精密度。

取同一批3種紅豆杉樹(shù)皮適量，每批平行制備6份供試溶液，在設(shè)定的液相色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定其中所含7種紫杉烷類化合物的含量，對(duì)紫杉烷類化合物的含量進(jìn)行比較，考察試驗(yàn)方法的重現(xiàn)性。

1.7 加樣回收率試驗(yàn)

取14份配制好的東北紅豆杉樣品溶液，分別加入對(duì)照品，2種標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量不同，在所設(shè)定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

加樣回收率計(jì)算公式為

(1)

式中：C1為所測(cè)功能成分總量；C2為樣品中功能成分質(zhì)量；M為加入標(biāo)準(zhǔn)品后功能成分質(zhì)量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用 Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖，用 SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測(cè)結(jié)果分析

2.1.1 不同高效液相色譜條件下檢測(cè)結(jié)果

已有研究中對(duì)紫杉烷的檢測(cè)方法較多[11-14]，但多限于3～5種物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)，且基線分離效果差，由于紫杉烷類化合物具有相近的極性和化學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致同時(shí)分析多組分紫杉烷類成分難度較大[15-17]。為了使7種紫杉烷類化合物完全分離、色譜圖基線平穩(wěn)，本研究考察了7種紫杉烷類化合物在228、250、273、227 nm 波長(zhǎng)下的出峰情況，以及4種不同流動(dòng)相(乙酸-甲醇、乙酸-乙腈、水-甲醇和水-乙腈)體系對(duì)各紫杉烷類化合物色譜出峰行為的影響[18-19]，圖1為不同波長(zhǎng)下檢測(cè)的出峰情況。最終確定為分離條件為乙腈-水，梯度洗脫(0～10 min，30%乙腈；10～12 min，30%～45%乙腈；12～25 min，45%乙腈；25～30 min，42%～45%乙腈；30～40 min，30%～42%乙腈)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm。液相分析方法的建立主要考察流動(dòng)相體系、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相比例；本實(shí)驗(yàn)分別采用4種流動(dòng)相體系及4種檢測(cè)波長(zhǎng)，根據(jù)7種紫杉烷類化合物的基線分離效果對(duì)流動(dòng)相體系和檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相比例是采用梯度洗脫，逐級(jí)摸索流動(dòng)相的比例確定，在液相方法的建立中通常給定最佳條件即可，因?yàn)槭翘荻认疵?，流?dòng)相比例是逐級(jí)改變的。

1.10-去乙酰基巴卡亭，2.巴卡亭Ⅲ，3.7-木糖-10-去乙?；仙即?，4.10-去乙酰基紫杉醇，5.三尖杉寧堿，6.7-表-10-去乙酰基紫杉醇，7.紫杉醇

圖2為在檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm、流動(dòng)相為水-乙腈優(yōu)化條件下各紫杉烷標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖，7種紫杉烷類化合物出峰順序?yàn)椋?0-去乙?；涂ㄍぁ涂ㄍあ?、7-木糖-10-去乙?；仙即?、10-去乙?；仙即?、三尖杉寧堿、7-表-10-去乙酰基紫杉醇、紫杉醇。

1.10-去乙?；涂ㄍ?2.巴卡亭Ⅲ,3.7-木糖-10-去乙?；仙即?4.10-去乙酰基紫杉醇,5.三尖杉寧堿,6.7-表-10-去乙酰基紫杉醇,7.紫杉醇

2.1.2 線性回歸分析

吸取對(duì)照品溶液2 mL，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%甲醇依次進(jìn)行2倍稀釋，在所設(shè)定的色譜條件下測(cè)定各紫杉烷類化合物含量。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，7種紫杉烷類化合物在所測(cè)定的線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)均在0.995 2以上。

表1 各紫杉烷類化合物各成分線性回歸結(jié)果

2.1.3 精密度和重現(xiàn)性分析

精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液，在所設(shè)定的色譜條件下進(jìn)行6次測(cè)定。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，在本試驗(yàn)檢測(cè)條件下，10-去乙?；涂ㄍ?、巴卡亭Ⅲ、7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇、10-去乙?；仙即肌⑷馍紝帀A、7-表-10-去乙?；仙即己妥仙即嫉纳V峰出峰時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.94%、0.33%、0.49%、0.64%、1.09%、1.59%、2.33%，表明儀器精密度良好。

取同一批3種紅豆杉樹(shù)皮適量，每批平行制備6份供試溶液，在所設(shè)定的色譜條件下進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明，色譜峰面積RSD分別為2.14%、2.82%、3.14%、1.27%、2.38%、3.22%、3.79%，說(shuō)明方法的重現(xiàn)性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，東北紅豆杉樣品中10-去乙?；涂ㄍ?、巴卡亭Ⅲ、7-木糖-10-去乙?；仙即?、10-去乙?；仙即肌⑷馍紝帀A、7-表-10-去乙?；仙即己妥仙即己科骄捣謩e為0.376、0.395 、0.266 、0.157 、0.092 、0.053 、0.234 mg/g，RSD值為1.74%、1.25%、1.20%、1.39%、1.09%、1.55%、1.58%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 加樣回收率

對(duì)不同添加量下7種紫杉烷類化合物的加樣回收率進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可得巴卡亭Ⅲ和10-去乙?；仙即嫉钠骄訕踊厥章首罡撸謩e為107.43%和104.88%，其中在樣品添加量為5 μg的時(shí)候效果最好，回收率分別為109.27%和108.31%。10-去乙?；涂ㄍぁ涂ㄍあ?、7-木糖-10-去乙?；仙即肌?0-去乙?；仙即?、三尖杉寧堿、7-表-10-去乙?；仙即己妥仙即嫉钠骄厥章史謩e為94.62%、107.43%、96.28%、104.88%、96.23%、95.41%和95.96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值分別為1.43%、2.09%、1.06%、2.23%、1.52%、1.43%和1.4%，均小于4%，表明1.3所確定的檢測(cè)方法回收率較好。

表2 7種紫杉烷類化合物加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.2 紅豆杉屬中7種紫杉烷類化合物含量分析與對(duì)比

影響紅豆杉植株中紫杉烷類物質(zhì)積累的因素十分復(fù)雜，不同品種、年限等因素均對(duì)其成分產(chǎn)生影響[6]。盆栽7年生3種紅豆杉屬植物(東北紅豆杉、南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉)主干樹(shù)皮中7種紫杉烷類化合物含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同品種紅豆杉中各紫杉烷類成分含量 (n = 5) Tab.3 Taxanes contents in different Taxus species (n = 5) mg·g-1

東北紅豆杉、南方紅豆杉、曼地亞紅豆杉樹(shù)皮中紫杉醇含量分別為0.234、0.043、0.167 mg/g，三尖杉寧堿含量分別為0.092、0.034、0.053 mg/g，10-去乙?；涂ㄍず糠謩e為0.376、0.158、0.063 mg/g，10-去乙酰基紫杉醇含量分別為0.157、0.113、0.126 mg/g，巴卡亭Ⅲ含量分別為0.395、0.116、0.074 mg/g，7-表-10-去乙?；仙即己糠謩e為0.053、0.027、0.033 mg/g，7-木糖-10-去乙?；仙即己糠謩e為0.266、0.564、0.315 mg/g。

因植物活性成分含量往往受地域、土壤、氣候、樹(shù)齡和品種等多種因素影響，為準(zhǔn)確比較不同紅豆杉品種中紫杉烷類成分含量差異，本研究采用溫室控制條件下培育的不同品種紅豆杉為實(shí)驗(yàn)材料，重點(diǎn)考慮品種因素對(duì)植物活性成分含量的影響，避免了其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。本研究所建立的檢測(cè)方法，不僅適用于溫室盆栽或林地紅豆杉樣品分析，也適用于其他生物樣品(動(dòng)物/人體血液、組織等)中紫杉烷類化合物的含量檢測(cè)，是一種廣譜性的高通量紫杉烷類化合物分析檢測(cè)方法。

不同種紅豆杉紫杉烷類化合物含量差異較大，紫杉醇和三尖杉寧堿含量以東北紅豆杉最高，其次是曼地亞紅豆杉，二者含量遠(yuǎn)高于南方紅豆杉。10-去乙酰基巴卡亭和巴卡亭Ⅲ的含量曼地亞紅豆杉最低，東北紅豆杉中最高，其中10-去乙?；涂ㄍぴ诼貋喖t豆杉中的含量不足其他2種紅豆杉的一半。10-去乙?；仙即己?-表-10-去乙酰基紫杉醇的含量在3種紅豆杉中差異較小。7-木糖-10-去乙?；仙即荚谀戏郊t豆杉中含量最高。7種紫杉烷類化合物總含量在東北紅豆杉中最高，南方紅豆杉其次，曼地亞紅豆杉中最低。

3 結(jié) 論

本研究開(kāi)發(fā)了一種高效、可同時(shí)測(cè)定紅豆杉屬植物中7種紫杉烷類化合物的HPLC的檢測(cè)方法：色譜柱HiQsil C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫(0～10 min，30%乙腈；10～12 min，30%～45%乙腈；12～25 min，45%乙腈；25～30 min，42%～45%乙腈；30～40 min，30%～42%乙腈)；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm。

7種紫杉烷類化合物的總含量在東北紅豆杉中最高，南方紅豆杉次之，曼地亞紅豆杉中最低。通過(guò)對(duì)紅豆杉屬植物中主要紫杉烷類成分含量的對(duì)比分析，為紅豆杉屬植物的質(zhì)量控制、種源選育、資源的保護(hù)與合理開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。