負載銅納米簇的氧化硅基雜化膠束制備及其化學動力學治療

孫奇奇， 李永生， 牛德超

（華東理工大學材料科學與工程學院，低維材料化學研究室，上海 200237）

因具有高復發率和高死亡率，惡性腫瘤至今仍是世界范圍內威脅人類生命健康最致命、最棘手的疾病之一[1]。在過去的幾十年里，化療和放療是臨床癌癥的主要治療方法[2-3]。盡管這些治療手段取得了顯著的進展，但是都有其自身的局限性，會對患者造成嚴重的副作用[4]。化學動力學療法（CDT）作為一種新興和有效的癌癥治療策略，最近在腫瘤治療領域受到了廣泛關注[5]。它是基于在芬頓試劑的催化下，在腫瘤區域將過氧化氫（H2O2）原位轉化為具有高細胞毒性的羥基自由基（?OH），從而引發細胞凋亡，抑制腫瘤生長[6-7]。鑒于H2O2在腫瘤微環境（TME）中過度表達的特點，?OH 僅在腫瘤區域產生，對正常組織幾乎沒有傷害，這使得CDT 成為了一種“綠色療法”[8]。鐵基納米材料作為經典的芬頓反應催化劑，已經被廣泛應用到CDT 研究中。然而，Fe2+介導的芬頓反應強烈依賴于酸性環境（pH 2～4），在生理中性的條件和弱酸性的腫瘤微環境（pH 6.5～6.9）下，反應相對低效[9-10]。即使在理想的酸性條件下，Fe3+/Fe2+的低轉化率也阻礙了芬頓反應的進行[11]，導致活性氧（ROS）生成緩慢，從而達不到理想的治療效果[12]。此外，TME 的另一個特點是谷胱甘肽（GSH）濃度過高，可達10 mmol/L[13]。GSH 作為細胞中一種重要的抗氧化劑，可以清除產生的?OH，減弱細胞的氧化還原作用，這種癌細胞中的抗氧化防御又成為CDT 發揮功效的一大障礙[14-15]。因此，亟需開發在弱酸性TME 中具有高催化活性和特異性的CDT 納米催化劑。

近年來研究發現，除Fe2+之外，其他金屬離子如Mn2+、Cu+、Cr4+和V2+也具有優異的類芬頓催化活性[16]。在這些金屬元素中，銅因其優異的特性而引人注目。首先，作為生物體中許多天然酶的輔因子，銅具有優異的生物相容性，廣泛參與體內的生化反應[17]。另外，與鐵相比，具有氧化還原活性的Cu+催化的類芬頓反應在動力學和能量上比Fe2+更有利。據文獻報道，銅離子的催化活性基本不受酸堿度的影響,其催化的類芬頓反應可以在弱酸性和中性介質中高效發生，Cu2+/Cu+（0.16 V）的氧化還原電位明顯低于Fe3+/Fe2+（0.77 V）[18]，最高反應速率（1×104mol/(L·s)）可達到Fe2+的160 倍[19]。更為重要的是，Cu2+向Cu+的轉化可以有效地消耗細胞內的GSH，減少ROS 的損失，還原產生的Cu+又可以與腫瘤細胞中的H2O2反應產生?OH，從而提高CDT 效率，進而增強抗腫瘤效果。

本文制備了一種銅納米簇負載的有機硅穩定的聚苯乙烯-b-聚丙烯酸（PS-b-PAA）膠束用于化學動力學治療研究。首先，通過引入3-巰基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS）對PS-b-PAA 的膠束結構進行固定，得到巰基改性的有機硅膠束。然后，借助銅離子與巰基較強的配位能力[20]，采用原位還原策略將銅物種負載到有機硅膠束中。結果表明，這種銅納米簇負載的有機硅膠束體系具有pH 響應特性，即在微酸的TME 環境中釋放Cu+，進而催化腫瘤細胞中過量表達的H2O2，產生高毒性的?OH。此外，腫瘤細胞中的GSH 又可將Cu2+還原為Cu+，消耗GSH 的同時進一步促進ROS 的持續生成，從而增強CDT 效率。因此，這種同時具備pH 響應和GSH 消耗特性的銅基CDT 試劑將為惡性腫瘤的高效、安全治療提供一種新的策略。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

PS-b-PAA：自制；MPTMS：分析純，Sigma-Aldrich；四氫呋喃（THF）：分析純，上海國藥化學制劑有限公司；氨水（NH3?H2O）：分析純，上海泰坦科技股份有限公司；二水合氯化銅（CuCl2?2H2O）：純度99%，上海泰坦科技股份有限公司；鹽酸（HCl）：分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）：純度98.35%，上海皓元生物醫藥科技有限公司；十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）：分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4?2H2O）：分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；氯化鈉（NaCl）：分析純，上海泰坦科技股份有限公司；亞甲基藍（MB）：純度98%，上海泰坦科技股份有限公司；GSH：純度98%，阿拉丁生物科技有限公司；雙氧水（H2O2）：w=30%，上海國藥化學制劑有限公司。

1.2 測試與表征

采用透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會社，JEM-2100F 型）在200 kV 工作電壓下進行樣品粒徑測試；采用動態光散射儀（DLS，英國馬爾文公司，Malvern ZEN3700 型）在室溫下檢測樣品的水合動力學尺寸和ζ電勢；采用X 射線衍射儀（XRD，德國布魯克公司，D8 Focus 型）在電壓40 kV、電流40 mA以及掃描速度8（°）/min 條件下測試樣品的XRD 圖譜；采用拉曼光譜儀（Raman，英國雷尼紹公司，inVia Reflex 型）得到樣品的拉曼光譜；采用場發射電子掃描顯微鏡（FESEM，日本日立公司，S-4800 型）進行樣品元素能譜分析；X 射線光電子能譜分析由X 射線光電子能譜儀（XPS，美國賽默飛世爾科技公司，250Xi 型）得到；采用紫外-可見光（UV-vis）分光光度計（日本島津公司，UV-3600 型）在室溫下檢測樣品的紫外-可見光光譜；采用電感耦合等離子體光譜儀（ICP-OES，美國安捷倫公司，752ES 型）測得樣品的Cu 含量；采用酶標儀（美國美谷分子儀器有限公司，SpectraMax M2 型）于室溫下對體外細胞毒性進行分析；采用細胞流式儀（美國碧迪公司，BD Accuri C6 型）進行流式細胞術分析。

1.3 PS-b-PAA 膠束（PMs）的制備方法

首先將20 mg PS-b-PAA 分散到10 mL THF 中，快速攪拌（600 r/min）30 min 直至完全溶解。然后保持劇烈攪拌的狀態，取40 mL 超純水迅速加入到上述混合溶液中，再繼續攪拌30 min。攪拌結束后，將溶液轉移到透析袋（MWCO 14000）中進行透析24 h，期間每隔4 h 換一次透析介質（去離子水）以除去多余的THF。透析結束后即得到PMs。

1.4 PS-b-PAA 有機硅膠束（POMs）的制備方法

將1 mL NH3·H2O 和50 μL MPTMS 逐滴加入到上述實驗所獲得的PMs 溶液中。然后在室溫攪拌24 h，接著將反應溶液轉移到透析袋中進行連續1 d的透析，以除去NH3·H2O 和多余的MPTMS，即得到POMs。

1.5 負載銅納米簇的PS-b-PAA 有機硅膠束（Cu-POMs）的制備方法

取2 mL CuCl2·2H2O 溶液（50 mmol/L）緩慢加入到18 mL 上述實驗所得到的POMs 溶液中，然后將混合溶液連續劇烈攪拌24 h。待攪拌完全后，再連續透析1 d 除去未反應的游離的銅離子，即獲得Cu-POMs。

1.6 Cu-POMs 的生物穩定性實驗

分別取1 mL Cu-POMs 溶液加入到2 mL pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液（PBS）和2 mL 含10%（體積分數）胎牛血清（FBS）的RPMI-1640 細胞培養液中。在預設的時間點連續用DLS 檢測其水合動力學粒徑的變化。

1.7 pH 響應的離子釋放

用ICP-OES 評估Cu-POMs 在不同pH 值（pH =7.4、6.5、5.0）的PBS 溶液中釋放的銅離子的量。簡而言之，將4 mL Cu-POMs 溶液密封在透析袋里，然后將透析袋分別放入到50 mL 不同pH 值（pH = 7.4、6.5、5.0）的PBS 溶液中，并進行適度攪拌。分別在0、1、2、4、8、12、24 h 的時間點收集5 mL 緩沖液，然后使用ICP-OES 檢測銅離子的濃度。每次取完緩沖液，再補充5 mL 新鮮的緩沖液。

1.8 羥基自由基（?OH）的檢測

通過MB 的降解實驗，評估Cu-POMs 對芬頓反應的催化能力和生成?OH 的能力。首先檢測了Cu-POMs 在不同pH 條件下生成?OH 的能力，將Cu-POMs 溶液分別添加到不同pH（7.4、6.5 和5.0）的含MB（20 μg/mL）和H2O2（100 μmol/L）的PBS 緩沖溶液中，再在預定的時間點（0、10、20、30、40、50、60 min）測其在664 nm 處的紫外吸光度。為了進一步探究GSH 是否會對Cu-POMs 生成?OH 的能力造成影響，將Cu-POMs 溶液分別添加到含有不同GSH 濃度（0、20 μmol/L 和10 mmol/L）的pH 為6.5 的 含MB（20 μg/mL）和H2O2（100 μmol/L）的PBS 緩沖溶液中，再在預定的時間點（0、10、20、30、40、50、60 min）測其在664 nm 處的紫外吸光度。MB 的降解率采用以下公式計算：

其中：A0和At分別表示樣品起始時刻和t時刻時的紫外吸光度。

采用相同的方法，評估了Cu-POMs 在pH為6.5，含有不同H2O2濃度（100、200、1 000 μmol/L）條件下生成?OH 的能力。

1.9 細胞實驗

1.9.1 細胞培養 采用人體肝癌細胞系SMMC-7721細胞（簡稱SMMC-7721 細胞）和小鼠胚胎成纖維細胞系NIH-3T3 細胞（簡稱NIH-3T3 細胞）進行體外細胞實驗。在含10%FBS 的RPMI-1640 培養基中培養SMMC-7721 細胞，而在含10%（體積分數）FBS 的DMEM 培養基中培養NIH-3T3 細胞。此外，所有細胞系均在體積分數5%的CO2氣氛和37°C 加濕環境下進行培養。

1.9.2 體外細胞毒性評價 以細胞計數試劑盒-8（CCK-8）測定SMMC-7721 細胞和NIH-3T3 細胞的活性，以此來評估Cu-POMs 的細胞毒性。具體操作如下：將細胞以每孔1×104個細胞的密度接種于96孔板中，按1.9.1 節方法分別培養SMMC-7721 細胞和NIH-3T3 細胞至細胞完全貼壁。然后用含Cu-POMs（Cu 質量濃度范圍1.5～24.0 μg/mL）的培養基代替原培養基孵育細胞24 h，之后換用CCK-8 溶液繼續培養2 h, 接著用酶標儀獲取其在450 nm 處的吸光度，以此計算細胞的相對存活率。此外，將不含納米顆粒的培養基培養的細胞用作對照。用相同的實驗方法，進一步探究了POMs 和H2O2對細胞的毒性。使用以下公式計算細胞的相對存活率：

其中：A和A'分別為用樣品處理的細胞的吸光度和對照組的吸光度，對照組的細胞定義為100%存活。

1.9.3 細胞凋亡分析 將SMMC-7721 細胞以每孔1×105個細胞接種在6 孔板中，并在培養箱中培養24 h。待細胞完全貼壁后，分別用含POMs，H2O2和Cu-POMs 的培養基與細胞共培養24 h。同樣地，用不含任何納米顆粒的新鮮培養基孵育的細胞作對照。共培養結束后，棄掉培養液并將細胞用PBS 洗滌3 次，然后用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶消化細胞，再通過離心（2 000 r/min，5 min）收集細胞，接著將收集的細胞分散到0.5 mL PBS 中，并用5 μL 膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和5 μL 的碘化丙啶（PI）溶液在避光條件下將細胞染色15 min。最后通過流式細胞儀檢測細胞的熒光，并基于染色的差異來確定細胞的凋亡情況。

2 結果與討論

2.1 Cu-POMs 的合成與表征

圖1 Cu-POMs 的制備流程示意圖Fig. 1 Schematic illustration of Cu-POMs

Cu-POMs 的制備流程示意圖如圖1 所示。首先將PS-b-PAA 分散至THF 中，待其溶解后再加入去離子水，由于兩親性嵌段共聚物具有在溶液中自組裝的特性，因此PS-b-PAA 自發形成了由親水性PAA外殼和親脂性PS 內核組成的膠束（PMs）。然后，引入含巰基的硅烷偶聯劑MPTMS，并利用其進行水解縮聚反應以穩定膠束結構，即有機硅烷分子在銨根離子的介導下會在PAA 鏈段區域進行水解縮聚，形成雙硫鍵交聯的有機硅網絡結構，從而得到POMs。最后，利用POMs 中有機硅中的巰基基團與銅離子的配位作用，通過原位還原得到Cu-POMs。

Cu-POMs 的TEM 圖片如圖2(a)～2(c)所示，可以觀察到合成的Cu-POMs 為44 nm 左右的球形納米顆粒，具有優異的分散性。另外，納米粒子表面有明顯的黑色小顆粒，推測是Cu 的納米簇。由TEM 圖片得到的粒徑分布直方圖（圖2(d)）顯示，Cu-POMs的粒徑分布區間較小，表明其粒徑均一。圖2(e)所示為POMs 及其合成的Cu-POMs 的Zeta 電位和水合動力學直徑，從中可以發現二者通過DLS 所測定的粒徑無明顯變化，均為90.0 nm 左右，大于通過TEM 所觀察到的粒徑。這是因為水合層的存在會對DLS 的激光有折射作用，從而造成了水合動力學粒徑偏大。不同的是，Cu-POMs 的Zeta 電位相較于POMs 明顯升高，由-28.6 mV 上升到了-16.7 mV，推測是引入的銅離子消耗了POMs 表面帶負電的巰基基團和羧基基團所致。

圖2 Cu-POMs 的透射電鏡照片（a）～（c）及其得到的粒徑分布直方圖（d）；POMs 和Cu-POMs 的Zeta 電位及DLS 粒徑（e）Fig. 2 TEM images (a)～(c) of Cu-POMs and the histogram of particle size distribution obtained from them (d); Zeta potential and DLS particle size of POMs and Cu-POMs (e)

圖3(a)是POMs 和Cu-POMs 的XRD 譜 圖，可以看出二者的結晶度均較低，在21°左右的主峰可推測為PS-b-PAA 膠束的峰。另外，Cu-POMs 中并未出現明顯的銅的化合物的特征峰，這可能是因為Cu 在POMs 上的存在形式為納米簇。為了進一步探究Cu-POMs 相較于POMs 表面巰基含量的變化，進一步利用拉曼光譜對PMs、POMs 和Cu-POMs 進行了分析，結果如圖3(b)所示。與PMs 相比，POMs 和Cu-POMs 均分別在510 cm-1處和2 570 cm-1處出現了二硫鍵（-S-S-）和巰基（-SH）的特征峰，這充分證明了MPTMS 成功引入到PMs表面，發生水解縮聚形成了有機硅層。此外，Cu-POMs 巰基的特征峰強度相較于POMs 有明顯的降低，表明其表面的巰基含量有所下降，這對應了Zeta 電位的表征結果，說明Cu 離子的引入確實消耗了POMs 表面的部分巰基。為了證實Cu-POMs 中Cu 元素的存在，進一步對Cu-POMs 進行了元素能譜（EDS）分析，如圖4(a)所示。從圖4(a)中可以看到，在0.9、8.0 keV和8.9 keV 處均出現了Cu 元素的特征峰，這證實了Cu 離子在POMs 上的成功負載。此外，Si 元素和S元素的存在則進一步證實了PMs 表面有機硅網絡的形成。為了進一步探究Cu-POMs 上Cu 元素的價態，利用XPS 對其進行分析。圖4(b)示出了Cu-POMs 的Cu 2p 譜圖，從圖中可以看出，在952.3 eV 和932.4 eV處有兩個主要峰，分別對應于Cu+的Cu+2p1/2和Cu+2p3/2，這與文獻報道的Cu+結合能值完全吻合[21]。此外，另有兩個特征峰分別在953.9 eV 和934.8 eV處，分別代表Cu2+的Cu2+2p1/2和Cu2+2p3/2[22]。以上結果為Cu-POMs 中Cu+的存在提供了可靠的證據，而Cu+的存在則是由于巰基將Cu2+還原所致。圖5所示是Cu-POMs 的暗場高分辨透射電鏡照片及其元素掃描分析，可以清晰地看到Cu 元素主要分布在膠束納米顆粒表面，這進一步證明了Cu 元素的成功負載。

圖3 POMs 和Cu-POMs 的XRD 譜圖（a）；PMs、POMs 和Cu-POMs 的拉曼光譜圖（b）Fig. 3 XRD patterns of POMs and Cu-POMs (a); Raman spectra of PMs，POMs and Cu-POMs (b)

圖4 Cu-POMs 的EDS 譜圖（a）和XPS Cu 2p 局部選區譜圖（b）Fig. 4 EDS (a) and local XPS spectra (b) of the Cu 2p region of Cu-POMs

2.2 Cu-POMs 的穩定性

納米材料的穩定性是衡量其能否在生物醫學領域應用的一個重要指標。圖6 所示的數碼照片顯示，120 h 后Cu-POMs 仍然具有優異的分散性，更重要的是，Cu-POMs 在不同介質中120 h 內的流體力學直徑無明顯變化，表明其擁有良好的生物穩定性。

2.3 Cu-POMs 的離子釋放

為了進一步驗證Cu-POMs 的生物安全性，探究了其在不同pH 條件下的離子釋放，結果如圖7 所示。在pH 7.4 的條件下，48 h 內銅離子的累積釋放量僅為10%左右，說明Cu-POMs 在生理環境中能夠維持穩定。對比鮮明的是，在pH 為6.5 和5.0 的環境中，Cu-POMs 的銅離子的累積釋放量顯著增加，分別達到了55%和69%。這一結果表明了Cu-POMs具有pH 響應特性，既能夠充分利用腫瘤中的微酸環境，同時也避免了其在正常組織中泄露出銅離子，進一步確保了其生物安全性。

2.4 類芬頓反應產生羥基自由基

眾所周知，能夠通過芬頓反應或者類芬頓反應產生具有高細胞毒性的羥基自由基（?OH）是納米藥物可用于癌癥的化學動力學治療的前提。由XPS的分析結果可知，Cu-POMs 的表面存在著豐富的Cu+，有望發生類芬頓反應生成?OH。本文通過MB 的降解實驗評估了Cu-POMs 催化H2O2產生?OH 的能力。

圖5 Cu-POMs 的高分辨TEM 圖像及其元素掃描分布Fig. 5 High-resolution TEM image of Cu-POMs and the corresponding element mapping

圖6 Cu-POMs 在不同介質中120 h 內的水合動力學粒徑（嵌入：120 h 時的數碼照片）Fig. 6 Hydrodynamic sizes of Cu-POMs stored in different mediums for 120 h (Insert: the digital photograph at 120 h)

圖7 Cu-POMs 在不同pH 的緩沖液和不同時間時銅離子的釋放Fig. 7 Cu ions release of Cu-POMs after coincubation with buffers with various pH at different time

鑒于Cu-POMs 具有pH 響應的特性，首先探究了在不同pH 下Cu-POMs 發生芬頓反應降解MB 的效率。圖8(a)所示為Cu-POMs 在不同pH 條件下加入100 μmol/L H2O2時MB 的時間-降解曲線，可以看出，在pH = 7.4 時，1 h 內MB 的降解率僅為15.9%，遠低于pH 為6.5 和5.0 條件下的43.0%和48.2%，這可能歸因于Cu-POMs 在低pH 的環境中會釋放出足量的Cu+，從而催化H2O2生成能夠使MB 褪色的?OH。另外，從反應10 min 后的紫外-可見光吸收光譜圖中也可以看出，pH = 7.4 時在664 nm 處的吸收峰強度幾乎無下降，而pH 為6.5 和5.0 時有明顯的降低（圖8(b)）。以上實驗結果表明，Cu-POMs 不僅能夠有效地發生類芬頓反應產生?OH，還能響應于TME 微酸的特性釋放Cu+。

圖8 MB 與Cu-POMs (ρ(Cu)=50 μg/mL)+H2O2(100 μmol/L)在不同pH 條件下反應后的降解-時間曲線（a）和紫外-可見光吸收光譜（b）Fig. 8 Degradation-time curves (a) and UV-Vis spectra (b) of MB treated with Cu-POMs (ρ(Cu) = 50 μg/mL), and H2O2(100 μmol/L) under different pH conditions

圖9 MB 與Cu-POMs (ρ(Cu)=50 μg/mL）+H2O2(100 μmol/L)在pH 6.5 和不同濃度的GSH 條件下反應后的降解-時間曲線（a）和反應10 min 后的紫外-可見光吸收光譜（b）Fig. 9 Degradation-time curves (a) and UV-Vis spectra (after 10 min reaction) (b) of MB treated with Cu-POMs(ρ(Cu) = 50 μg/mL), and H2O2 (100 μmol/L) at pH 6.5 under different concentration of GSH conditions

腫瘤細胞內較高濃度的GSH 可以消耗?OH，從而使得CDT 治療效果大打折扣。幸運的是，具有高還原性的GSH 可以還原由Cu+催化H2O2生成的Cu2+，將其再次轉化為高催化活性的Cu+。因此，進一步探究了不同濃度的GSH 對Cu-POMs 發生類芬頓反應的影響。如圖9(a)所示，相較于不添加GSH 的組，反 應60 min 時，GSH 濃 度 為20 μmol/L 組 的MB 降解率稍有提高（45.9%），更明顯的是，GSH 濃度為10 mmol/L 組的降解率增高至57.2%。從圖9(b)中也可看出，實驗進行到10 min 時，GSH 濃度為20 μmol/L和10 mmol/L 組在664 nm 處的吸收峰強度均比不外加GSH 組的低。以上實驗結果證明了GSH 可以促進Cu-POMs 中Cu+的再生，從而提高類芬頓反應的效率。

另外，探究了不同濃度的H2O2對Cu-POMs 發生類芬頓反應產生?OH 的影響。從圖10(a)中可以看出，反應60 min 時H2O2濃度分別為100、400、1 000 μmol/L 條件下，MB 的降解率分別為43.0%，54.7%和64.2%。圖10(b)也顯示10 min 后，1 000 μmol/L組在664 nm 處的吸收峰強度最低。以上實驗結果表明，通過上調H2O2的濃度也可以提高類芬頓反應的效率。

2.5 Cu-POMs 的細胞毒性

圖10 MB 與Cu-POMs （ρ（Cu） = 50 μg/mL）和不同濃度的雙氧水在pH 6.5 條件下反應后的降解-時間曲線（a）和反應10 min 后的紫外-可見光吸收光譜（b）Fig. 10 Degradation-time curves (a) and UV-Vis spectra (after 10 min reaction) (b) of MB treated with Cu-POMs(ρ(Cu) = 50 μg/mL), and different concentration of H2O2 at pH 6.5

圖11 SMMC-7721 細胞與不同濃度的H2O2 孵育24 h 后的細胞存活率Fig. 11 Cell viabilities of SMMC-7721 cells after 24 h incubation with various concentrations of H2O2

在進行Cu-POMs 的細胞毒性實驗之前，首先探究了H2O2對SMMC-7721 細胞的影響。圖11 示出了SMMC-7721 細胞與不同濃度的H2O2孵育24 h 后的細胞存活率。圖11 可以看出，當H2O2濃度不高于200 μmol/L 時，H2O2對SMMC-7721 細胞的殺傷作用幾乎沒有。然而，當H2O2濃度為500 μmol/L 時，細胞存活率出現了明顯的下降，特別地，當H2O2濃度為1 000 μmol/L 時，細胞存活率僅為16.1%。雖然過高濃度的雙氧水可以有效地殺死腫瘤細胞，但TME中過表達的雙氧水水平也僅為100 μmol/L 左右，所以需要通過其他途徑來抑制和消除腫瘤細胞。進一步探究了Cu-POMs 對腫瘤細胞的毒性作用。圖12(a)所示為SMMC-7721 細胞與POMs 或Cu-POMs 共同孵育24 h 后的細胞存活率，從圖中可以看出，POMs組的細胞存活率幾乎均接近100%，表明POMs 無法殺死腫瘤細胞。對比鮮明的是，隨著材料濃度的增大，Cu-POMs 對SMMC-7721 細胞的毒性也呈現出增大的趨勢，特別地，當Cu-POMs 質量濃度為480 μg/mL（ρ（Cu） = 24 μg/mL）時，細胞存活率只有55.0%，與POMs 構成了顯著性差異。另外，將NIH-3T3 細胞與POMs 或Cu-POMs共同孵育24 h 后，即便材料質量濃度達到480 μg/mL時，POMs 和Cu-POMs 均未表現出明顯的細胞毒性（圖12(b)）。這充分說明了POMs 基的納米材料具有良好的生物安全性，Cu-POMs 對細胞造成毒性的選擇性表達，可歸因于它的pH 響應特性。

為了進一步探究Cu-POMs 對腫瘤細胞的毒性作用，利用流式細胞術對SMMC-7721 細胞的凋亡情況進行了分析，結果如圖13 所示。

圖12 SMMC-7721 細胞（a）和NIH-3T3 細胞（b）與不同濃度的POMs 或Cu-POMs 孵育24 h 后的細胞存活率Fig. 12 Cell viabilities of SMMC-7721 cells (a) and NIH-3T3 cells (b) after 24 h incubation with POMs or Cu-POMs at various particle concentrations. Data were presented as mean ± SD (n=5, *p＜0.05, ***p＜0.001)

圖13 與不同樣品共孵育24 h 并通過Annexin-V/PI 試劑染色后的SMMC-7721 細胞的流式細胞術分析結果Fig. 13 Flow cytometry analysis of SMMC-7721 cells after 24 h incubation with different samples and staining by Annexin-V/PI reagents

從圖13 中可以看出，與對照組相比，POMs 組和H2O2組的細胞幾乎無凋亡和壞死，表明了POMs和TME 中H2O2濃度 (100 μmol/L)不會對腫瘤細胞造成殺傷。然而，Cu-POMs 組的腫瘤細胞凋亡率高達57.5%，進一步表明了Cu-POMs納米粒子有作為CDT試劑的潛力，在腫瘤治療領域擁有良好的應用前景。

3 結 論

（1）采用一種簡便的“原位還原”策略制備了粒徑約為44 nm 的Cu-POMs，其具有良好的均一性與分散性，在不同介質中120 h 內的流體力學粒徑無明顯變化，具有優異的生物穩定性。

（2）Cu-POMs 具有pH 響應和GSH 消耗特性，能夠充分利用TME 中微酸環境和GSH 過表達的特點，催化H2O2生成高細胞毒性的?OH。同時，還能避免在正常組織中泄露出銅離子，確保了生物安全性。