冠心病繼發認知障礙的動物模型研究進展

王 青，劉鳳嵐，徐仕晗，劉艷飛，劉 玥，徐鳳芹

1. 中國中醫科學院西苑醫院老年二科（北京 100091）

2. 中國中醫科學院西苑醫院國家中醫心血管病臨床醫學研究中心（北京 100091）

3. 廣東藥科大學研究生院（廣州 510006）

冠心病和認知障礙是老年人多發病、常見病，隨著人口老齡化的加劇，其患病率呈持續增長趨勢，對社會和公共衛生產生重大影響。認知功能障礙指患者的記憶、語言、視空間、執行、計算、理解判斷等方面出現一項或多項受損。冠心病與認知障礙的發生密切相關[1]，冠心病患者認知損害或癡呆發生風險平均可增加45%[2]。Greaves等研究顯示，約40%接受心臟搭橋手術的冠心病患者在術后1至5年內被診斷為認知障礙[3]。穩定性冠心病患者隨訪4年后，認知障礙發生率為42.4%[4]。

冠心病患者認知功能障礙發病機制可能類似于血管認知功能障礙，主要有腦小血管病[5]、動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）[6]、血小板高度激活[7]、慢性炎癥[8]等假說。冠心病繼發認知障礙的潛在生物學機制尚不清楚，而構建合適的動物模型是揭示其發病機制的基礎。本文對當前各類冠心病繼發認知障礙實驗動物模型的制備方法、相關評判指標作一總結，以期為深入研究冠心病繼發認知障礙發病機制和評價相關治療藥物的作用提供動物模型參考。

1 實驗對象的選擇

疾病動物模型可在病理學研究、發病機制探討、藥效學及生物標志物的驗證等方面發揮作用[9]。冠心病常用的實驗動物有大鼠、小鼠、兔、小型豬、豚鼠、犬等，認知損傷建模目前涉及的動物有大鼠、小鼠、沙土鼠、斑馬魚、果蠅以及羊類、犬類、靈長類動物（狒狒、食蟹猴、恒河猴）等[10]。在眾多動物中，嚙齒類動物最為常用，其具有與人類基因水平高度同源、免疫力及對外界環境的適應力強、存活率高、繁殖快、易獲得等特點[11]，故被更多研究者所選用。鑒于此，目前在冠心病繼發認知障礙的動物模型制備時，最常選用的實驗動物是大鼠和小鼠。

應用大鼠進行冠脈疾病動物模型制備和研究的歷史悠久，尤其是在建立心肌梗死模型方面，原因是大鼠冠脈系統穩定且側支循環缺乏，發生心梗時心肌壞死出現早，且與人類臨床心肌梗死和充血性心力衰竭的病理生理過程較為相似[12]。Wistar和SD大鼠是現今國內外應用最多的大鼠品系，其中Wistar大鼠被廣泛應用于神經-內分泌實驗研究；SD 大鼠的神經系統與人類相似，常被用于如獎勵懲罰實驗、迷宮實驗等反映高級神經功能和學習記憶的研究中[13]。臨床上由心腦血管疾病引起慢性缺血性腦灌注不足所致血管性認知障礙動物模型的建立常用手術結扎或阻塞損傷腦部供血的主要血管制備，選擇大鼠模型更易操作，且術后出現的認知功能障礙比小鼠更加明顯[14]。同樣，在阿爾茨海默病等神經退行性疾病中也常用大鼠制備動物模型，此外，大鼠有更強的快速學習能力，能夠更好地執行學習與認知研究相關任務，與人類疾病表現更為相似[15]。

小鼠與人類的血脂成分不同，具有心血管保護作用的高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-Ch）在其體內含量較高，而致冠狀動脈粥樣硬化作用的低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-Ch）含量偏低，因此不易形成AS斑塊[16]。但隨著基因敲除技術的發展，轉基因小鼠模型被越來越多的研究者使用。如目前最常見的載脂蛋白E基因敲除小鼠（ApoE-/-小鼠），它是以近交系鼠C57BL/6小鼠為背景的基因敲除鼠，相較于普通小鼠，其發生AS、冠心病的可能性更高，經高脂喂養后更易成模[17]。載脂蛋白 E（ApoE）屬于可交換載脂蛋白家族，具有基因多態性，可能通過調節脂質代謝和轉運與冠心病相關，有研究表明攜帶APOEε4等位基因的急性冠脈綜合征患者在出院后半年隨訪時有著較高的心血管終點事件發生率[18]。另外，APOE也是主觀認知功能下降、輕度認知障礙和阿爾茨海默病的易感基因，攜帶APOEε4等位基因、主觀認知下降的患者腦淀粉樣變性病變患病率是非攜帶者的2～3倍[19]。Tam等研究了人類和APOE靶向替換轉基因小鼠APOE基因與腸道微生物組成間的關系，研究發現通過調節腸道微生物群或許能夠減輕APOEε4等位基因對認知功能下降的有害影響[20]。因此ApoE-/-小鼠不僅是目前冠心病、AS研究的經典模型，在認知功能障礙等神經退化性疾病領域中也有所應用。Goodarzi等對阿爾茨海默病再生醫學動物模型的研究認為小鼠具有體積小、成本低、適合大樣本研究的優勢，并指出轉基因小鼠模型有助于研究與阿爾茨海默病相關基因的功能機制[15]。

2 冠心病繼發認知障礙動物模型的構建方法

目前，對于冠心病動物模型的制備方法較為成熟，但冠心病繼發認知障礙的制模方法仍在探索中，對現有相關模型的制備方法進行歸納梳理后發現多是在成功復制冠心病模型的基礎上再進行認知功能的評價，現將常用模型制備方法介紹如下。

2.1 高脂飼料誘導模型

AS的發生發展與冠心病密切相關。有研究顯示在AS狀態下，體內存在微栓塞、腦心輸出量減少、炎癥因子釋放等現象，它們可能與認知損傷有關[21]。通過高脂飼料誘導是目前復制冠狀動脈粥樣硬化實驗動物模型的基礎制備方法。高脂飼料通常是在常規飼料的基礎上加入適量的膽固醇、豬油、豆油、蛋黃粉等，具體依據所選動物、造模方法及實驗設計而定。研究表明單純高脂飲食很難誘導出AS病變[17]，鑒于大鼠本身無膽囊且具有抗AS特性，故選用大鼠建模時，高脂飼料中需添加膽酸鈉（促進膽固醇吸收）和丙基硫氧嘧啶（減少對膽固醇的代謝）[22]。

雖然高脂飼料誘導基本符合人類AS形成過程，但是其用時長，且難以造出晚期AS病變，因此更多以高脂喂養為基礎，聯合腹腔注射維生素D3、基因改造、冠脈結扎、機械損傷、免疫炎癥誘導等方法構建冠心病動物模型[23]。有研究顯示，給予Wistar大鼠腹腔注射維生素D3（2 mL/kg，連續3 d，分3次）后，聯合高脂飼料喂養12周可成功建立冠狀動脈粥樣硬化大鼠模型[24]。因人類血管壁中鈣含量與冠心病嚴重程度呈正相關，維生素D3可增加血鈣濃度致使動脈血管壁被破壞，從而加速AS的發生[25]。盧令慧等研究采用左冠狀動脈前降支結扎術結合高脂飲食喂養SD大鼠28 d，通過檢測心電圖、血脂水平、超聲心動圖等成功復制了冠心病氣虛血瘀痰濁的病證結合動物模型，成模率為66.7%[26]。

2.2 轉基因動物模型

目前大部分的轉基因動物為不同品系小鼠，用其建模可以更好地理解疾病的生物學基本特性。ApoE-/-小鼠是冠心病基礎研究中最為經典的一種轉基因小鼠模型，由于其體內缺乏ApoE，導致LDL代謝障礙，使得血漿膽固醇濃度顯著升高，是非基因敲除鼠的8倍之多[27]。人和小鼠ApoE的同源性達70%，即使是給予普通飲食也能誘發AS，并易致易損斑塊形成，而高脂飲食可加速上述進程[28-29]。Li等對經高脂飼料喂養12周的ApoE-/-小鼠取頭臂動脈和冠狀動脈行病理檢測發現管腔內均有斑塊形成，血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、LDL-C水平顯著升高，表明成功復制了冠心病模型[30]。microRNA的主要功能是通過與其mRNA識別序列結合來調節靶蛋白轉錄后表達，有報道稱microRNA-1在心臟中過度表達可導致神經元微管損傷[31]。Duan等采用心臟特異性高表達的microRNA-1轉基因小鼠進行實驗，發現小鼠心臟和海馬中的microRNA-1水平均升高，且伴隨著突觸小泡的重新分布和胞吐相關蛋白表達的降低[32]，這是對心血管疾病導致認知功能障礙在分子機制方面作出的探索。

2.3 冠狀動脈結扎模型

目前經冠狀動脈結扎法制作心肌缺血、心肌梗死模型已較為成熟[33]。通過結扎左冠狀動脈前降支阻斷冠脈供血，造成管腔狹窄或閉塞，進而致心肌缺血缺氧甚至壞死，該過程在血流動力學及心肌代謝方面的改變與臨床上冠心病患者心肌缺血及心梗時的發病過程較為相似[34]。具體操作為：在呼吸機支持下將雄性成年SD大鼠麻醉后，于左側第3、4脅間切口，打開胸腔并撕開心包，輕壓兩側胸壁，將心臟擠出于胸腔外，用6-0號線于左心耳下2 mm處結扎左冠狀動脈前降支，建立心肌梗死模型，造模成功率為83%，術后24 h存活率為77%[35]。結扎一段時間，使冠狀動脈再通，即為心肌缺血再灌注模型。既往研究報道，C57BL/6J小鼠結扎左冠狀動脈3個月后（成活率84%）出現了顯著的認知障礙，并伴有β-淀粉樣蛋白代謝、凋亡和炎癥的改變，表明心肌梗死后癡呆的可能性增加[36]。

2.4 化學干預模型

冠脈供血不足會導致心肌缺血，是冠心病的主要病變基礎，短暫缺血會引起心絞痛，嚴重缺血可致心肌梗死[37]。心肌功能受損可通過缺氧或代謝底物耗竭引起的改變對腦、腎、肝等其他灌流器官產生不良影響，認知功能減退是心臟功能受損引起神經元組織低灌流所致的主要臨床表現之一[38]。異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）是一種人工合成的β受體激動劑，可引起心肌過強過快收縮，冠脈發生痙攣，增加心肌耗氧，出現心肌缺血、壞死等現象，可用于心肌缺血、藥物性心肌損傷、心肌梗死等疾病的模擬，更符合臨床冠心病的病理過程[39]。常用10～120 mg·kg-1·bw-1劑量的ISO連續兩次或多次對嚙齒類動物進行皮下注射制備心肌梗死模型[40]。據報道，給予Wistar或SD大鼠連續2 d（間隔24 h）皮下注射ISO 85 mg·kg-1·bw-1[41]或 100 mg·kg-1·bw-1[42]后，均可見心功能顯著下降、血清心肌損傷標志物升高、心肌組織水腫伴炎癥及壞死，表示成功構建了心肌梗死模型。有研究者通過對SD大鼠皮下注射 85 mg/kg ISO和慢性輕度應激刺激模擬了心肌梗死后抑郁狀態的動物模型[43]。Tóth等利用ISO成功誘導了Wistar大鼠急性交感神經應激狀態，并對大鼠的心臟損傷、神經炎癥、腦功能和認知行為進行了觀察與評估[44]。幾種常用冠心病繼發認知障礙動物模型的比較見表1。

表1 幾種常用冠心病繼發認知障礙動物模型的比較Table 1. Comparison of several commonly used animal models of cognitive impairment secondary to coronary heart disease

3 常用檢測指標及評價方法

3.1 冠心病相關評估

對冠心病動物模型制備的評價方法已基本達成共識，如高脂飼料誘導所致的冠狀動脈粥樣硬化的評估主要集中在血脂水平和主動脈、心肌組織的病理染色上，也有對心肌損傷標志物及炎性因子的血清學檢測。冠狀動脈結扎法或ISO誘導法所致的心肌缺血、心肌梗死模型評價方法主要是心電圖、定量組織學和血清酶學等綜合指標的測定。

3.2 認知功能評估

目前對動物認知功能的評估多采用行為學評價方法，也有研究根據實驗目的結合組織病理學、影像學等進行判斷。有報道指出，目前探究動物行為學實驗的方法以Morris水迷宮為主，Y迷宮、八臂迷宮、主動/被動回避、跳臺實驗等為輔，并且各種新型改良版放射迷宮也在不斷出現，研究者可根據實驗需要及實驗動物進行合理選用[45]。

3.2.1 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮是一種研究嚙齒類動物空間學習和記憶能力的測試裝置，目前被廣泛用于學習記憶能力、認知障礙、衰老等方面的研究，主要包括定位航行實驗和空間探索實驗兩部分[46]。

王玉選取8周齡ApoE-/-小鼠予高脂飼料喂養12周后，檢測血脂發現TC、TG、LDL含量明顯增加、HDL明顯減少，HE染色示主動脈有明顯的斑塊形成，說明AS建模成功；模型組小鼠的Morris水迷宮實驗逃避潛伏期與游泳總路程明顯增加、穿越平臺次數顯著減少，提示其出現認知功能障礙，且乙酰膽堿酯酶、β-淀粉樣蛋白及相關炎性因子的表達顯著增加，成功建立了因AS繼發的輕度認知障礙小鼠模型[47]。Ravindran等以ISO溶液80 mg/kg連續兩次對Wistar大鼠行皮下注射，給藥第2 d見心電圖ST段抬高，血漿中乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）和缺血修飾白蛋白（IMA）水平顯著升高，第8 d取心組織行心梗面積測定及HE染色觀察發現肌原纖維排列嚴重紊亂、中性粒細胞大量浸潤，并伴有水腫，說明心肌梗死建模成功；在此期間采用Morris水迷宮和放射臂迷宮測試評估ISO誘導的心肌損傷對大鼠學習和記憶能力的影響，結果顯示與假手術組相比，模型組大鼠需要更多的時間到達平臺且參考記憶錯誤數量顯著增加，表明模型小鼠學習和記憶能力逐漸下降，建立了心梗后的認知障礙大鼠模型[48]。

3.2.2 Y迷宮實驗

Y迷宮主要是利用嚙齒類動物對新環境探索的天性來實施，以測定它們的空間工作記憶能力，被廣泛用于認知功能減退、趨向性、空間學習記憶等領域[49]。

有研究對SD大鼠連續高脂飼料喂養10周，期間分3次給予維生素D3腹腔注射（第1周60萬 IU/kg、第3周10萬 IU/kg、第6周10萬IU/kg），第10周末取材檢測發現大鼠血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、LDL升高，油紅O和HE染色可見斑塊形成、主動脈管壁增厚、平滑肌細胞排列紊亂、數量增加，說明AS造模成功；持續4周的有氧運動干預后行Y迷宮實驗，結果顯示模型組大鼠空間識別能力和工作記憶能力受損，與對照組相比，在空間識別實驗中進入新異臂次數減少、停留時間縮短，同時取腦海馬組織檢測顯示海馬代謝異常以及突觸可塑蛋白表達受損[50]。Koji Ito等通過對10周齡的ICR小鼠行左冠狀動脈結扎制備心肌梗死模型，術后1周和4周行超聲心動圖示心肌梗死組小鼠的左心室內徑明顯小于假手術組，并通過行Y迷宮測試評價其認知功能，發現心肌梗死組小鼠的自發交替次數顯著低于假手術組小鼠，表明心肌梗死模型小鼠的空間工作記憶能力下降，出現認知障礙，并且下丘腦和海馬區的腦Sigma-1受體（S1R）表達降低，而S1R的減少在精神障礙的發病機制中起重要作用[51]。

3.2.3 主動/被動回避實驗

回避實驗是利用動物的喜暗惡光（明暗穿梭）、對厭惡刺激（如足電擊）的恐懼和記憶而建立起來的，用來評估嚙齒類動物的空間學習記憶能力，主要是反應皮質功能[52]。主動位置回避是指動物在一個緩慢旋轉的圓形舞臺中有某一固定的電擊區域，若動物進入該區域則會受到輕微電擊，動物通過學習避免進入該區域，研究者通過對電擊次數、回避所需時間及運動路徑等數據進行記錄以評估認知功能情況[53]。被動回避測試中的避光實驗是利用嚙齒類動物喜暗特性，實驗時將動物放入一個由明、暗兩室組成的裝置中，當其由明室進入暗室時即會遭受一次電刺激令其返回明處，從而獲得記憶的訓練，之后間隔24或48 h記錄動物從明室進入暗室的間隔時間（即潛伏期）和電擊次數，潛伏期越長、受電擊次數越少表示學習和記憶力越好[54]。

有研究為了探究心肌梗死與認知功能減退及血管性癡呆的關系，對5～6月齡的雄性C57BL/6小鼠進行左冠狀動脈結扎成功建立心肌梗死小鼠模型，4周后通過主/被動回避實驗對小鼠進行學習和記憶能力評估，結果發現與假手術組相比，心肌梗死小鼠的被動回避潛伏期顯著減少，主動回避潛伏期增加，說明心肌梗死后C57BL/6小鼠的記憶明顯受損、認知功能減退[55]。

3.2.4 新物體識別實驗

新物體識別實驗是根據動物對熟悉物體和新異物體探索時間的長短來檢測其識別記憶能力的方法。實驗主要分為適應期、 熟悉期和測試期三個階段。適應期時將動物放入沒有任何物體的實驗裝置中，使其自由探索并適應實驗環境；熟悉期是將兩個完全相同的物體放入，記錄動物與其接觸的情況；測試期是將其中一個熟悉物體換成新物體，觀察并記錄動物對它們的探索時間，把探索新物體和熟悉物體所用的時間分別記為TN和TF，并計算識別指數（recognition index，RI），即RI= TN/（TN+TF）×100%，最后通過上述指標評估動物的認知記憶能力[56]，當被測試動物未遺忘環境中見過的熟悉物體，便會用更多的時間探究未見過的新物體，在熟悉物體上的探索時間就越短。

Hovens等用冠脈前降支結扎法制備心肌缺血再灌注模型，術后2周（成活率72%）對Wistar大鼠進行認知行為測試，新物體識別實驗及Morris水迷宮實驗皆表明大鼠的空間記憶、學習能力下降[57]。

3.2.5 其它評估方法

認知障礙的病因相當復雜，其涵蓋了認知功能下降、輕度認知功能障礙到癡呆的整個疾病過程，在動物模型的評價上，除上述認知行為學的測評外，部分病理學及影像學的改變亦可作為提示。阿爾茨海默病的病理表現主要有細胞外淀粉樣蛋白沉積、神經纖維纏結以及神經元數目減少等[58]。Bereczki等實驗研究顯示ApoB-100轉基因小鼠在高脂飲食喂養18周后主動脈血流量減少了25%，并在其海馬、大腦皮層和下丘腦中發現了廣泛的神經元死亡和淀粉樣斑塊，磁共振成像顯示小鼠第三腦室和側腦室增大，提示ApoB-100的過表達與神經退行性病變有關[59]。Yuan等制備SD大鼠急性心肌缺血再灌注模型，術后3 d HE病理染色可見大鼠海馬CA1區神經元損傷嚴重、排列紊亂，表明神經細胞凋亡，免疫組化示小膠質細胞活化，八臂迷宮實驗示工作記憶錯誤次數增加，說明心肌缺血再灌注大鼠存在認知功能障礙[60]。

4 結語

目前冠心病的模型制備方法較為成熟，如AS、心肌缺血、心肌梗死等疾病狀態的動物模型制備均有多種方法可供選擇，但檢索文獻并歸納整理后發現冠心病繼發認知障礙的動物模型尚無穩定或較為公認的制備方法。如今常用的構建方法是首先按照常用的、可靠的模型建立方法成功制作出冠心病的動物模型，然后通過嚙齒類動物行為學檢測方法篩選出所需的認知障礙模型，但這可能存在成功率偏低、評估方法不統一的問題。

在實驗動物的選擇上，從冠心病和認知障礙疾病領域來看，雖然非人靈長類動物是理想的動物來源，但是由于價格高昂、獲取來源不便、實驗條件較高，在實際操作中可行性并不高；而嚙齒類動物因其操作方便、來源可靠、可大規模復制，故被廣泛使用。在模型的制備上多根據研究目的及研究疾病的病理特征來選用，如由心肌梗死引起的認知障礙中，用冠狀動脈結扎法在大鼠上建立模型已較為成熟，且可供使用的評估方法可行性強。

需要指出的是，目前對認知障礙的評判方法還多集中在動物行為學的測評方面，因此存在一定的局限性。因人類的認知功能本就復雜，單純的行為學測試不足以完全表達，必要時應結合先進的神經電生理技術、影像學、組織病理學等方法綜合評估。此外，由于研究者關注的重點是冠心病繼發認知障礙，因此并不能使用冠心病模型疊加認知障礙模型，即所謂的復合模型，這種先制備出冠心病模型，再用其他措施誘導出認知障礙的方法不符合研究目的，也無法展示疾病本身的病理過程。理想的動物模型應是與臨床發病機制切合，且來源易獲取、可操作性強、成本適宜的。因此探索開發穩定可靠、重復性好、成模率高的冠心病繼發認知障礙的動物實驗模型對該病的研究具有重要的意義。未來應加強基于臨床特征的并病動物模型的研發，對于新藥研發及深入認識疾病的病理生理機制非常重要。