逆轉錄聚合酶螺旋反應快速檢測蜱傳腦炎病毒方法的建立及初步評價*

閆美田，鄭雨桐，萬 楠

北部戰區總醫院檢驗科，遼寧沈陽 110016

蜱傳腦炎病毒(TBEV)又名森林腦炎病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬中的烈性病毒，其基因組為單股正鏈RNA，長約11 kb，經蜱叮咬傳播[1-2]，會引發以中樞神經系統病變為主要特征的森林地區自然疫源性疾病[3]，感染者可出現發熱、劇烈頭痛、神經功能紊亂、外周性弛緩性麻痹等癥狀，甚至死亡[4-5]，嚴重威脅人類健康。近年來，軍隊森林駐扎頻繁，林業人員和開發者采伐活動增多，加之森林游、野外游等旅游業的發展，蜱叮咬的概率大大增加，從而增加了TBEV感染的風險。為確保基層和野戰現場對TBEV進行早期防控，掌握最佳救治的良機，本研究擬建立逆轉錄聚合酶螺旋反應(RT-PSR)法，以對TBEV進行現場快速檢測。

1 材料與方法

1.1主要試劑 2×EasyTaq PCR SuperMix、pGM-T克隆試劑盒、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、FlyCut SalⅠ、T7 High Efficiency Transcription Kit、EasyPure RNA Purification Kit、EasyPure Blood RNA Kit購自北京全式金生物技術有限公司，SYBR Green Ⅰ、DNase/RNase-Free Water、石蠟油購自北京索萊寶科學技術有限公司，Bst 3.0 DNA聚合酶購自NEB公司，甜菜堿購自Sigma公司。

1.2模板制備 在GeneBank中下載49種TBEV序列，通過BLAST分析選取保守區，發現NS1基因保守性、同源性較高，因此參考TBEV森張株序列(NO.JQ650523)選取NS1基因上的310 bp序列(第2 892～3 201位核酸序列)由安徽通用公司人工合成基因片段，連接到pGM-T載體上(pGM-T克隆試劑盒，北京全式金生物技術有限公司)，并轉化到TOP10感受態細胞中，以25%甘油進行菌液儲存，提取的質粒經SalⅠ單酶切線性化、純化后通過體外轉錄試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)制備RNA標準品。

1.3引物設計 以TBEV森張株序列保守區NS1基因上的310 bp序列為模板，應用Primer 5.0設計一對螺旋引物(Ft/Bt)，該引物由PCR的正、反向引物(F/B)和植物序列(Nr/N)組成，Nr和N序列順序彼此相反，F和B的Tm值比Nr和N高5 ℃以上，以確保F和B與目的基因結合早于螺旋[5]，引物由通用生物系統(安徽)有限公司合成。RT-PSR 檢測TBEV時所用引物序列和Tm值見表1。

表1 RT-PSR 檢測TBEV時所用引物序列和Tm值

1.4RT-PSR體系的建立及優化 由于Bst 3.0 DNA聚合酶不是熱啟動酶，需要在冰上建立反應體系，根據先前實驗摸索出的成分及用量建立共25 μL的RT-PSR反應體系：8 U Bst 3.0 DNA聚合酶，2.5 μL的10×Isothermal Amplification Buffer Ⅱ，0.8 mol/L甜菜堿，4 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，Ft、Bt各1.6 μmol/L，RNA模板1.0 μL，最后加DNase/RNase-Free Water補齊到25.0 μL。以TBEV基因組RNA為模板，根據已建立的反應體系進行RT-PSR，以DNase/RNase-Free Water為陰性對照。為了防止氣溶膠污染，在反應液上層加入25 μL的石蠟油,接下來在65 ℃恒溫金屬浴中反應55 min。擴增結果用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。由于瓊脂糖凝膠電泳需要配膠和電泳，操作復雜并且耗時長，為了更滿足基層現場的檢測條件，本研究通過加1.0 μL 1∶20稀釋過的SYBR Green Ⅰ到反應體系中，通過肉眼觀察顏色變化來快速判斷反應結果。在65 ℃金屬浴中反應55 min，對RT-PSR條件進行優化，設置溫度梯度為60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃，Bst 3.0 DNA聚合酶濃度梯度為2、4、6、8、10、12 U，甜菜堿濃度梯度為0.2、0.5、0.8、1.1、1.4 mol/L,MgSO4濃度梯度為4、6、8、10 mmol/L，dNTPs濃度梯度為1.0、1.4、1.8、2.2 mmol/L，以上條件確定后將反應時間設定為30、35、40、45、50、55、60 min，根據1.5%瓊脂糖凝膠電泳條帶的亮度和清晰度來選出最佳反應條件。

1.5RT-PSR特異性及靈敏性分析 使用實驗室先前合成的融合基因(西尼羅病毒、乙型腦炎病毒、 墨累谷腦炎病毒)和TBEV的RNA標準品在同等條件下應用RT-PSR進行檢測，驗證該方法的特異性。測定人工合成的TBEV RNA質量濃度為107.341 ng/μL，進行10倍梯度稀釋(依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍)，分別取1 μL進行PCR和RT-PSR擴增，應用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證兩種方法的檢測限，并進行靈敏性比較。

1.6模擬全血標本檢測 由于TBEV是烈性病毒，不易收集臨床標本，因此選取體檢健康的全血標本為模擬標本的基質，加入已知質量濃度的TBEV RNA，制備7個濃度的模擬標本，全血中TBEV RNA的終濃度分別為107.34×10-1、107.34×10-2、107.34×10-3、107.34×10-4、107.34×10-5、107.34×10-6、107.34×10-7ng/μL，以純全血標本作為陰性對照。按照EasyPure Blood RNA Kit說明書進行RNA提取。

2 結 果

2.1RT-PSR體系的建立及優化 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，TBEV基因組出現明顯的梯狀條帶，陰性對照無條帶，TBEV基因組的SYBR Green Ⅰ由橙色變為綠色，陰性組保持橙色不變，并且在紫外燈下TBEV基因組可見綠色熒光，陰性組無熒光。結果表明，SYBR Green Ⅰ可作為RT-PSR的指示劑(圖1)，驗證了建立的RT-PSR反應體系的可行性。在60～65 ℃條件下，61 ℃條帶最亮、最清晰；在同等溫度條件下分別加入2～12 U Bst 3.0 DNA聚合酶，結果顯示，6 U的Bst 3.0 DNA聚合酶條帶最亮、最清晰；分別加入0.2～1.3 mol/L的甜菜堿，結果顯示0.5 mol/L濃度的甜菜堿結果最理想；4、6、8、10 mmol/L濃度梯度的MgSO4中，結果顯示8 mmol/L的結果最理想；確定dNTPs的濃度為1.8 mmol/L;在不同時間范圍內進行反應(30～60 min),最終確定反應時間為55 min時最理想(圖2)。

注：A為 1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果，M為5 000 DNA標記物，1為TBEV的RNA標準品，N為陰性對照(DNase/RNase-Free Water)；B為 SYBR Green Ⅰ在自然光下擴增產物的顯色結果；C為SYBR Green Ⅰ在紫外光下擴增產物的顯色結果；B、C中1、2為TBEV的RNA標準品，3、4為陰性對照(DNase/RNase-Free Water)。

注：A為優化RT-PSR擴增的溫度；B為優化Bst 3.0 DNA聚合酶的濃度；C為優化甜菜堿的濃度；D為優化MgSO4濃度；E為優化dNTPs的濃度；F為優化RT-PSR的反應時間；M為5 000 DNA標記物；N為陰性對照(DNase/RNase-Free Water)。

2.2RT-PSR特異性及靈敏性分析 電泳結果顯示，含有TBEV的RNA標準品才呈現標準的梯形條帶，而西尼羅病毒、乙型腦炎病毒、墨累谷腦炎病毒的融合基因和陰性對照沒有明顯條帶,有TBEV的RNA標準品在自然光下SYBR Green Ⅰ由橙色變為綠色，而融合基因和陰性對照在自然光下SYBR Green Ⅰ仍為橙色，只有TBEV的RNA標準品在紫外光下發出綠色熒光，結果表明，RT-PSR可特異檢測出TBEV(圖3)。已稀釋的模板分別進行PCR和RT-PSR，電泳結果顯示，PCR在107.34 ng/μL稀釋10-1、10-2、10-3、10-4倍時有條帶，當質量濃度低于107.34×10-4ng/μL時無明顯條帶，RT-PSR在107.34 ng/μL稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍時有條帶，當質量濃度低于107.34×10-6ng/μL時無明顯條帶，指示劑在自然光和紫外光下顯色結果與電泳結果相同，可見RT-PSR最低檢測限是PCR的100倍，見圖4。

注：A為1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果；B為自然光下SYBR GreenⅠ的RT-PSR反應結果；C為紫外光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR結果；M為5 000 DNA標記物，1為TBEV RNA，2為融合基因(西尼羅河病毒、日本腦炎病毒、墨累谷腦炎病毒)；N為陰性對照(DNase/RNase-Free Water)。

注：A、B為1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果；C為自然光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR結果；D為紫外光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR結果；M為5 000 DNA標記物，1～8 TBEV RNA質量濃度分別為107.34×10-1、107.34×10-2、107.34×10-3、107.34×10-4、107.34×10-5、107.34×10-6 、107.34×10-7 、107.34×10-8 ng/μL，N為陰性對照(DNase/RNase-Free Water)。

2.3模擬全血標本 RT-PSR檢測7種不同濃度的TBEV模擬全血標本，結果表明符合率為100%，見圖5。最低檢測限為107.341×10-5ng/μL，靈敏性比RNA標準品低10倍。

注:A為1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果；B為自然光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR結果；C為紫外光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR結果；M為5 000 DNA標記物；1～7為質量濃度分別為107.34×10-1、107.34×10-2、107.34×10-3、107.34×10-4、107.34×10-5、107.34×10-6 、107.34×10-7 ng/μL 的TBEV模擬全血標本；N為陰性對照(體檢健康者的純全血標本)。

3 討 論

聚合酶螺旋反應(PSR)是2015年LIU等[6]團隊發明的一種新的等溫核酸擴增方法，利用Bst DNA聚合酶的鏈置換功能、熱穩定性及DNA聚合酶活性，以及甜菜堿解開DNA雙鏈的作用進行檢測，該方法只需要一對引物(Ft/Bt)，即在PCR的正、反向引物的5′端加上植物序列Nr/N，并且Nr和N序列彼此相反，從而實現反復的引物延伸(①→②、③→④)、解鏈(②→③、④→⑤)、置換(⑤)、卷曲(⑥)，接下來卷曲結構的3′端繼續向前延伸(⑦)，最終通過自螺旋方式(⑧)大量擴增(圖6)，從而實現簡單快速、高靈敏性和特異性檢測。

目前,已有研究人員應用PSR方法進行細菌、真菌及病毒的檢測[7-11]，而先前適當研究對RNA病毒檢測時需要在反應前進行逆轉錄或者是在反應體系內加入逆轉錄酶等才能實現PSR擴增，本研究建立的RT-PSR僅需一種酶，即Bst 3.0 DNA聚合酶，它不僅具有鏈置換活性，還具有耐高溫逆轉錄酶活性，在等溫條件下一種酶可同時實現逆轉錄和核酸擴增。此外，PSR反應體系中加入顏色指示劑，可以通過陰陽性反應的顏色差異現場快速判斷實驗結果。

注：①→②、③→④為引物延伸，②→③、④→⑤為解鏈，⑤為置換，⑥為卷曲，⑦為延伸，⑧為通過自螺旋方式擴增。

TBEV分為3個亞型，歐洲型TBEV(TBEV-Eu)、西伯利亞型TBEV(TBEV-Sib)和遠東型TBEV(TBEV-FE)[4,12]，我國流行的主要是TBEV-FE，流行主要地區有吉林、黑龍江和內蒙古地區，新疆和云南也有病例出現[13]。目前TBEV感染的檢測方法有血清學方法及核酸檢測方法，但是血清學方法要求待檢驗品的抗原、抗體含量高，而且檢測靈敏度較低，易出現“窗口期”導致漏檢；核酸檢測方法主要是PCR，需要反復變溫循環和元件精密的復雜儀器，時間成本和經濟成本較高，核酸檢測領域還有分子雜交等技術，但成本高昂、操作煩瑣。本研究建立RT-PSR在恒溫條件下只需一對特異性引物就可實現核酸大量擴增，具有高特異性、高靈敏性、節約時間和成本等優點，可實現基層現場對TBEV的精準檢測，能夠對TBEV進行早期防控，對感染者進行早期治療，避免后遺癥,甚至死亡的發生。

本研究根據RT-PSR方法的原理，以TBEV NS1基因序列設計一對引物Ft/Bt,對反應條件及主要成分采用單因素變化法進行優化，最終確定的反應條件為在25.0 μL的反應體系中：6 U的Bst 3.0 DNA聚合酶，0.5 mol/L的甜菜堿，8 mmol/L的MgSO4，1.8 mmol/L的dNTPs，1.0 μL的RNA模板，Ft、Bt各1.0 μL，加入無菌無酶水補齊25.0 μL，61 ℃恒溫金屬浴中反應55 min。SYBR Green Ⅰ 能與雙鏈DNA結合，由橙色變為綠色，紫外光下會發出熒光，但SYBR Green Ⅰ 會抑制PSR反應，因此需要反應結束后開蓋加入[14]。

當前的核酸擴增方法對于RNA需要事先進行逆轉錄,而RT-PSR檢測方法最佳反應溫度61 ℃，逆轉錄酶的活性為30～68 ℃，正好包括了RT-PSR的最佳反應溫度,因此可以逆轉錄和擴增同時進行；當前的核酸擴增方法要么需要95 ℃初始變性，要么需要加入DNA解旋酶，而RT-PSR檢測方法只需加入甜菜堿，當達到反應溫度時，便可以使DNA雙鏈解開，達到單雙鏈的動態平衡。

由于TBEV是烈性病毒，不易收集標本，因此本研究制備了7種不同濃度模擬全血標本，用RT-PSR進行檢測，將檢測結果與加入RNA標準品進行對比，評價該方法檢測實際全血感染標本的能力。本研究結果表明，用該RT-PSR檢測模擬標本的符合率可達到100%，最低檢出濃度為107.341×10-7ng/μL，提示RT-PSR檢測方法可以對全血標本中微量的TBEV進行準確檢測。

綜上所述，RT-PSR檢測方法對TBEV具有良好的特異性和靈敏性，檢測限是PCR的100倍。此外，該方法所用儀器簡單、成本低(水浴鍋或者恒溫金屬浴)，只需要一種酶，通過觀察指示劑的顏色變化即可判斷結果，操作簡便，反應穩定性高，實現了現場快速檢測，有助于基層對TBEV的早期診斷。