MICM綜合分析在骨髓增生異常綜合征診斷中的應(yīng)用效果*

陳思宇，彭賢貴，楊武晨，鄧小娟，張 曦，王 平

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液病醫(yī)學(xué)中心，重慶 400037

骨髓增生異常綜合征(MDS)是起源于造血干細(xì)胞的克隆性髓系異質(zhì)性的疾病，其特點(diǎn)是造血功能異常，表現(xiàn)為單系或多系外周血血細(xì)胞減少，高風(fēng)險(xiǎn)向急性髓系白血病(AML)轉(zhuǎn)化[1]。目前，MDS診斷主要依靠骨髓涂片(BMS)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)[2]，然而MDS的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，某一時(shí)間點(diǎn)難以完全明確診斷，診斷率僅70.48%[3]。目前，骨髓病理活檢、流式細(xì)胞免疫學(xué)、分子生物學(xué)等新技術(shù)逐漸應(yīng)用于MDS診斷，多技術(shù)聯(lián)檢雖然提高了MDS的診斷率，但因?qū)嶋H臨床工作中送檢組合不一致，不同診斷技術(shù)的觀察分析側(cè)重不同，各自獨(dú)立報(bào)告，極易導(dǎo)致MDS診斷結(jié)果不一，甚至相互沖突。本研究對(duì)MDS多技術(shù)送檢情況及各技術(shù)診斷MDS的問(wèn)題進(jìn)行分析，利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)(簡(jiǎn)稱(chēng)MICM)綜合分析修正診斷MDS，以期為臨床提供精準(zhǔn)有效的實(shí)驗(yàn)診斷依據(jù)，現(xiàn)將具體結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2021年12月就診于該院血液病醫(yī)學(xué)中心的60例外周血細(xì)胞減少(至少1系血細(xì)胞減少)且骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)疑診為MDS的患者作為研究對(duì)象。60例疑診為MDS患者年齡17～84歲，中位年齡59歲；男女性別比例為1.72∶1.00；白細(xì)胞計(jì)數(shù)為2.57×109/L(1.58×109/L，3.95×109/L)，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)為2.35×1012/L(1.92×1012/L，2.73×1012/L)，血紅蛋白為70 g/L(65 g/L，85 g/L)，血小板計(jì)數(shù)為42×109/L(12×1012/L，116×1012/L)。所有患者經(jīng)臨床需求不同程度完善骨髓活檢(BMB)、流式細(xì)胞免疫學(xué)(FCM)、細(xì)胞遺傳學(xué)(CGM)、分子生物學(xué)等檢測(cè)。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，以及所有受試者的知情同意。

1.2方法

1.2.1MDS檢測(cè)及診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)血液系統(tǒng)腫瘤和急性白血病分類(lèi)參照WHO 2016版標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行；(2)BMS細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)和骨髓象診斷意見(jiàn)參照《血液病學(xué)診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]，骨髓活檢(BMB)在髂后上棘進(jìn)行，長(zhǎng)度不少于1.5 cm，觀察造血組織面積與增生度、紅系病態(tài)造血與異位、粒系病態(tài)造血與異位、巨核系發(fā)育異常與計(jì)數(shù)、肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)、靜脈竇內(nèi)骨髓浸潤(rùn)現(xiàn)象、網(wǎng)硬蛋白纖維染色等，行Gomori銀染色和免疫組化，檢測(cè)標(biāo)志包括CD34、MPO、GPA、CD61、CD42、CD68、CD20和CD3。病理活檢CD34+前體細(xì)胞結(jié)節(jié)/片簇分布且組織面積≥造血細(xì)胞面積30%為骨髓病理AML界限。(3)利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)積分系統(tǒng)(FCSS)[6]對(duì)MDS進(jìn)行積分，主要包括以下抗體：CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD33、CD13、CD117、CD15、CD11b、CD64、CD34、HLA-DR、CD14、CD56、CD16、CD38、CD45及同型對(duì)照。當(dāng)FCM診斷FCSS積分≥2分時(shí)考慮MDS。(4)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)主要包括染色體核型和熒光原位雜交技術(shù)(FISH)。染色體核型異常按人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制[ISCN(2020)]描述，F(xiàn)ISH檢測(cè)MDS常見(jiàn)異常熒光探針包括5q31、CEP7、7q31、CEP8、20q、CEPY。(5)基因突變檢測(cè)流程參照《二代測(cè)序技術(shù)在血液腫瘤中的應(yīng)用中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)(2018年版)》[7]，MDS檢測(cè)項(xiàng)目包括TP53、TET2、DNMT3A、IDH1/2、EZH2、ASXL1、SRSF2、RUNX1、U2AF1、SETBP1等。

1.2.2MICM 綜合分析 MDS不同檢測(cè)技術(shù)的診斷由對(duì)應(yīng)領(lǐng)域中級(jí)職稱(chēng)者報(bào)告，然后由3名從事血液系統(tǒng)疾病診斷20余年的高級(jí)職稱(chēng)病理醫(yī)生進(jìn)行MICM綜合分析。MDS診斷參照《骨髓增生異常綜合征中國(guó)診斷與治療指南(2019年版)》[8]中的標(biāo)準(zhǔn)。其中血細(xì)胞減少的標(biāo)準(zhǔn)為中性粒細(xì)胞絕對(duì)值<1.8×109/L，血紅蛋白<100 g/L，血小板計(jì)數(shù)<100×109/L。

1.3評(píng)價(jià)指標(biāo) (1)MDS診斷技術(shù)(BMS、BMB、FCM、CGM)的一致性；(2)MICM綜合分析與BMS、BMB、FCM、CGM檢測(cè)的特異度、靈敏度和準(zhǔn)確度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中計(jì)量資料以M(P25,P75)表示，BMS、BMB、FCM、CGM檢測(cè)MDS的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Kappa檢驗(yàn)判斷多種檢測(cè)方法與形態(tài)學(xué)結(jié)果對(duì)MDS診斷的一致性，以Kappa>0.750為一致性較好。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

MICM綜合分析顯示，60例疑似MDS患者中，BMB 檢測(cè)MDS 58例、FCM 檢測(cè)MDS 57例、CGM檢測(cè)MDS 54例、二代測(cè)序技術(shù)(NGS)檢測(cè)MDS 34例，見(jiàn)圖1。以最終臨床診斷為依據(jù)，60例患者中，6例未完成MICM綜合檢測(cè)，MDS無(wú)法明確診斷。Kappa檢驗(yàn)結(jié)果顯示，與BMS診斷的比較，BMB、FCM和CGM結(jié)果支持MDS診斷的一致性較差(Kappa=0.076、0.344、0.099，均<0.750)。54例患者得到最終診斷，MICM綜合分析與不同技術(shù)的靈敏度和特異度見(jiàn)表1。54例MICM綜合分析患者中，明確診斷MDS 42例(其中3例MDS經(jīng)BMB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)骨髓纖維化，3例MDS經(jīng)FCM檢出單克隆B淋巴細(xì)胞)，5例經(jīng)BMB或FCM診斷為急性髓系白血病(AML)，2例經(jīng)FCM診斷為淋巴母細(xì)胞淋巴瘤伴骨髓增生異常改變，5例MDS證據(jù)仍然不足，進(jìn)入臨床觀察隨訪。

注：MLD為多系病態(tài)造血，RS為環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞，SLD為單系病態(tài)造血，EB為原始細(xì)胞增多;柱狀圖中的數(shù)字為MDS亞型對(duì)應(yīng)例數(shù)。

表1 MICM綜合分析與BMS、BMB、CGM診斷MDS的相關(guān)參數(shù)(n=54，%)

3 討 論

MDS發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，疾病特征、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查均具有明顯的異質(zhì)性，給診斷帶來(lái)一定的困難。目前，MDS的診斷仍然主要依靠骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷，在判斷細(xì)胞病態(tài)造血表現(xiàn)、原始特征和種類(lèi)及細(xì)胞分化階段上易受操作者主觀判斷[9]，其診斷結(jié)論常常受到臨床質(zhì)疑。隨著病理活檢、流式細(xì)胞免疫學(xué)、分子生物學(xué)等新技術(shù)的應(yīng)用，MDS診斷的準(zhǔn)確度得到明顯提升。雖然MICM各技術(shù)的應(yīng)用取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，部分納入了MDS診斷或預(yù)后分層中，但目前并沒(méi)有形成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的診斷體系。

MDS的診斷是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，目前MDS診斷指南[4]中提出的最低診斷標(biāo)準(zhǔn)依賴(lài)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)被認(rèn)為是MDS診斷的重要依據(jù)，BMS形態(tài)檢有利于骨髓細(xì)胞病態(tài)情況的觀察，但在觀察骨髓造血全貌和 MDS分型診斷中準(zhǔn)確率并不高[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞形態(tài)學(xué)是基于顯微鏡下可辨識(shí)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常，診斷率為70.48%[3]，本研究中BMS診斷率為74.07%，高于文獻(xiàn)[3]報(bào)道，可能與本研究中選擇對(duì)象的偏倚有關(guān)。有研究指出，骨髓穿刺活檢利于骨髓組織變化(如骨小梁變化、骨髓壞死，以及纖維化、膠樣化等)的觀察，并且檢測(cè)過(guò)程受骨髓細(xì)胞與基質(zhì)黏附力和纖維化程度等的影響較小[11]，可彌補(bǔ)部分BMS和外周血形態(tài)檢測(cè)的不足，但其單獨(dú)檢測(cè)對(duì)MDS及其分型診斷的靈敏度、特異度仍較低，本研究中BMB診斷的靈敏度為84.62%，高于文獻(xiàn)[11]報(bào)道，可能原因是本中心BMB為血液病診斷專(zhuān)科平臺(tái)并具有較深厚的細(xì)胞形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。FCM是一種高靈敏檢測(cè)技術(shù)，雖還沒(méi)有納入MDS診斷標(biāo)準(zhǔn)，有研究顯示，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞發(fā)育異常的靈敏度高于細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析[12-13]。CHU等[14]提出，F(xiàn)CSS能很好地彌補(bǔ)國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)(IPSS)和世界衛(wèi)生組織分型預(yù)后積分系統(tǒng)(WPSS)的缺陷。本研究中,FCM運(yùn)用FCSS診斷的特異度和靈敏度較高，更重要的是FCM的MDS誤診率更低，僅為33.33%。主要原因是FCM能夠鑒定MDS原始細(xì)胞克隆性，免疫表型分析可判斷原始細(xì)胞的良惡性質(zhì)及系別，補(bǔ)充細(xì)胞形態(tài)學(xué)對(duì)原始細(xì)胞比例小于5%的鑒別難點(diǎn)，尤其原始細(xì)胞過(guò)氧化物酶陰性的情況。目前，MDS克隆性造血標(biāo)志主要依賴(lài)非隨機(jī)染色體核型異常，異常核型的檢出對(duì)MDS的診斷具有重要價(jià)值[15]。在本研究中，MDS相關(guān)染色體異常發(fā)生率為40.74%，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道大致相同。染色體異常的出現(xiàn)可能早于形態(tài)異常，細(xì)胞遺傳學(xué)發(fā)生與MDS相關(guān)的畸變，對(duì)MDS的早期診斷具有重要意義。但是核型異常并非MDS所特有[17]。因此，核型異常需聯(lián)合血細(xì)胞病態(tài)造血形態(tài)學(xué)特征及其他臨床等特征綜合判斷。

BMS、BMB、FCM、GCM、NGS在MDS診斷中均體現(xiàn)出不同程度的診斷價(jià)值，由于患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和醫(yī)院項(xiàng)目開(kāi)展等原因，臨床懷疑MDS的患者進(jìn)行MICM聯(lián)合檢測(cè)的項(xiàng)目并不完全。各技術(shù)診斷MDS的一致性較差(Kappa<0.750)，Kappa從高到低依次為FCM、CGM、BMB(Kappa=0.344、0.099、0.076)。MDS診斷技術(shù)中，BMS和FCM在病態(tài)造血和細(xì)胞發(fā)育顯示明顯優(yōu)勢(shì)，診斷率分別74.07%、70.37%，BMB和CGM次之。盡量選擇MDS高診斷率技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，在MDS二聯(lián)診斷中，BMS+FCM聯(lián)合可能更優(yōu)于BMS+BMB和BMS+CGM組合。本研究結(jié)果顯示，MICM綜合分析明顯優(yōu)于單一診斷，MICM對(duì)MDS診斷靈敏度為95.35%，特異度為90.91%，準(zhǔn)確度為97.62%。本研究中，MICM綜合分析修正了15例(27.77%)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)的疾病診斷和MDS分型，降低了漏診率(4.65%～14.89%)及誤診率(9.09%～28.57%)。

MICM綜合分析利用流式免疫學(xué)在系別分型上的優(yōu)勢(shì)，觀察到3例MDS伴單克隆B淋巴細(xì)胞增加，2例MDS的初診糾正為淋巴瘤伴繼發(fā)性MDS改變；對(duì)于低增生性 MDS 和 MDS 伴有骨髓纖維化的患者只能通過(guò)BMB切片才能診斷。在預(yù)后評(píng)估方面，骨髓纖維組織的有無(wú)及增生程度與MDS的克隆增生性相關(guān)，是獨(dú)立的不良預(yù)后因素[18]。本研究依然將骨髓或外周血形態(tài)學(xué)診斷的髓系原始細(xì)胞比例≥20% 定義為形態(tài)學(xué)診斷AML標(biāo)準(zhǔn)；補(bǔ)充病理活檢CD34+前體細(xì)胞結(jié)節(jié)/片簇分布且組織面積≥造血細(xì)胞面積30%，修正形態(tài)學(xué)原始細(xì)胞<造血細(xì)胞面積20%為AML界限。本研究中，有5例形態(tài)學(xué)診斷MDS-EB2，經(jīng)BMB顯示原始細(xì)胞CD34+前體細(xì)胞滿(mǎn)足AML條件，其中2例FCM粒、單、紅三系發(fā)育異常診斷，綜合修正為MDS轉(zhuǎn)化的急性髓系白血病(MDS-AML)或急性髓系白血病伴骨髓增生異常相關(guān)改變(AML-MRC)。結(jié)果未見(jiàn)待排MDS病例中經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)觀察涉及5q-、7q-等細(xì)胞遺傳學(xué)改變，當(dāng)形態(tài)學(xué)未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)(一系或多系細(xì)胞發(fā)育異常比例<10%)，但同時(shí)伴有持續(xù)性血細(xì)胞減少的患者，如檢出具有MDS診斷價(jià)值的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，應(yīng)診斷為MDS未分類(lèi)型(MDS-U)[4]，進(jìn)而修正診斷。因此，多技術(shù)MICM綜合分析能夠不同程度修正MDS的形態(tài)學(xué)診斷。骨髓病理活檢對(duì)MDS伴骨髓纖維化或AML的診斷具有特殊價(jià)值，F(xiàn)CM表型分析是確定原始細(xì)胞來(lái)源的金標(biāo)準(zhǔn)，可以鑒別淋巴瘤骨髓侵犯伴髓系病態(tài)造血；經(jīng)典的染色體核型異常是診斷病態(tài)造血現(xiàn)象不完全滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)的MDS克隆證據(jù)。

綜上所述，MDS的實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)各有優(yōu)劣，多技術(shù)聯(lián)合檢查能夠提高M(jìn)DS診斷率，可降低骨髓形態(tài)學(xué)等單一技術(shù)的誤診率，MICM是一種高效能的綜合分析方法。然而，MDS是一個(gè)動(dòng)態(tài)的發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，某一時(shí)間點(diǎn)的MICM有時(shí)仍不能完全診斷，追求更高靈敏度和特異度需要納入NGS等新技術(shù)并結(jié)合臨床進(jìn)行分析。同時(shí)，尚需建立MICM綜合分析MDS的應(yīng)用規(guī)則，收集更多臨床病例進(jìn)行效果驗(yàn)證。