TRMT61A在肝癌細胞中的功能及其機制研究

胡哲軒，張 欣，沃璐璐，李靜池，王 嬌，周佽想，趙 倩，2

1.上海交通大學醫學院病理生理學系，細胞分化與凋亡教育部重點實驗室，上海 200025；2.中國醫學科學院應激與腫瘤創新單元（2019RU043），上海 200025

肝癌是一種常見的消化系統惡性腫瘤。據統計，2020 年肝癌的發病率和病死率在惡性腫瘤中分別居于世界第6 位和第3 位；尤其在男性腫瘤患者中，肝癌的病死率排名第2 位［1］。原發性肝癌有多種類型，其中肝細胞肝癌約占所有病例的90%，是最常見的一種肝癌類型［2］。肝細胞肝癌發病的危險因素多種多樣，主要包括慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）或丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染、長期飲酒、2型糖尿病等。近年來，非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）正快速發展為肝細胞肝癌高危病因之一［3］。手術切除和肝移植一直以來是肝細胞肝癌主要的根治性治療手段。除了常規治療方案之外，針對早期肝癌的局部射頻消融術、治療中期肝癌的肝動脈化療栓塞、經動脈放射栓塞等不同手段均展現出良好的治療前景［4-5］。然而，肝細胞肝癌仍缺乏有利于前期診斷的生物學標志物，其發生和發展機制也尚未研究清楚。

N1-甲基腺苷（N1-methyladenosine，m1A）是一種轉錄后水平的RNA 甲基化修飾，指腺苷酸第一位N 原子甲基化修飾，最早在不同生命體的tRNA 核苷酸位點上（9、14、22、57、58）被發現。在哺乳動物中，最具有代表性和高度保守性的tRNA 修飾位點位于第9 位和第58 位核苷酸。研究發現，這2 個位點上的m1A 修飾都與tRNA 的結構穩定性和正確折疊相關［6］，如在酵母中tRNA 第58 位核苷酸m1A 修飾（m1A58） 的缺失會導致攜帶起始密碼子的tRNAMet 發生降解［7］。TRMT6/TRMT61A 復合體是負責催化真核生物tRNA 上m1A58 修飾的腺嘌呤甲基轉移酶，其中TRMT61A 屬于催化蛋白亞基，TRMT6 屬于RNA 結合亞基［8］。越來越多的研究發現，異常的m1A 修飾與不同的病理生理過程或疾病相關。數據庫分析研究結果顯示，在包含肝細胞肝癌的多種消化系統腫瘤患者標本中m1A 修飾水平異常升高，提示m1A修飾可能參與不同腫瘤發生和發展過程［9-10］。然而，關于m1A修飾如何影響肝細胞肝癌的發生和發展的研究并不多。本研究以2 種肝癌細胞（Huh7細胞和HepG2細胞）作為疾病細胞模型，探究m1A 修飾甲基轉移酶亞基TRMT61A對肝癌細胞功能的影響，為進一步探索m1A修飾對肝細胞肝癌發生和發展的影響，進而探索該病新的診斷、治療方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

肝癌細胞系HepG2 購于ATCC；Huh7 細胞系由本課題組長期保存于液氮中。CCK-8試劑盒［東仁化學科技（上海）有限公司］，碘化丙啶（propidium iodide，PI）（Sigma，美國），甲基藍（methyl blue，MB）染色液、結晶紫染液、Annexin V/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），TRMT61A 抗體［愛必信（上海）生物科技有限公司］，cyclin D1 抗體、cyclin E1 抗體、β-tubulin 抗體（Proteintech 公司，美國），m1A 抗體（Abcam 公司，英國），P53 抗體、PARP 抗體、cleaved caspase3 抗體、P21 抗體（CST 公司，美國），臺盼藍染液、TRIzol、Lipofectamine 2000 轉染試劑（Invitrogen 公司，美國），高糖DMEM 培養基（上海源培生物科技股份有限公司），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Sigma 公司，美國），ECL 顯影液（上海圣爾生物科技有限公司）。

1.2 細胞培養

人肝癌細胞系Huh7 和HepG2 細胞均培養于37 ℃、5%CO2的恒溫細胞培養箱中，均采用含10%FBS 的DMEM 培養基進行培養。每日觀察細胞狀態與生長密度，2～3 d進行細胞傳代。

1.3 生物信息學分析

使用GEPIA 生物信息學網站（http：//gepia.cancer-pku.cn/）在線分析TCGA 數據庫中TRMT61A在肝癌患者癌與癌旁組織中的表達情況。其中，肝癌組織樣本數為369，癌旁組織樣本數為50。使用該網站在線繪制高表達或低表達TRMT61A肝癌患者生存曲線。

1.4 構建穩定敲低TRMT61A 肝癌細胞系及細胞分組

設 計 并 合 成TRMT61A的2 條sgRNA （single guide RNA）引物序列，分別為1 號、2 號片段，在引物兩端添加酶切位點，磷酸化引物并退火。將sgRNA 連接于酶切后的lentiCRISPRv2 載體上，分別構建質粒并測序鑒定。將含1 號、2 號片段的質粒各自與慢病毒包裝質粒共轉染293T 細胞，收集48 h 或72 h 病毒上清，感染目的細胞Huh7 和HepG2 肝癌細胞系。感染1 號片段病毒上清所得的細胞作為1 號敲低組（KD-1 組），感染2 號片段病毒上清所得細胞為2 號敲低組（KD-2 組），僅轉染包裝質粒病毒上清感染所得細胞為對照組（NC 組），用嘌呤霉素（puromycin） 進行最終篩選。使用有限稀釋法在96 孔板中挑選單克隆，依次過渡到24 孔板、12 孔板和6 孔板，最后通過蛋白質印跡法（Western Blotting） 檢測細胞TRMT61A 蛋白水平確定陽性克隆。

1.5 斑點印跡實驗檢測細胞總RNA水平m1A修飾

對照組、KD-1 組、KD-2 組細胞用TRIzol 裂解，常規提取細胞RNA，定量并稀釋至1 μg/μL。取適量RNA 于65 ℃處理5 min 使其變性，滴于尼龍膜上，進行紫外自動交聯。1×PBST 溫和洗去膜上未結合RNA，使用5%牛奶（脫脂奶粉與1×PBST 配制） 封閉1 h。1×PBST 溫和清洗，使用m1A 抗體（2 μg/mL，5%BSA 配制）室溫孵育1 h。1×PBST 溫和清洗3 次，5 min/次。使用抗兔二抗室溫孵育1 h。1×PBST 溫和清洗3 次，5 min/次。孵育顯影液曝光顯影。孵育甲基藍染液20 min，染色總RNA，掃描膜成圖。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖

將對照組細胞和敲低組細胞按照1 000 個/孔種于96 孔板中，同時每組按3 000、6 000、12 000、24 000個細胞梯度種于96孔板，設置3個復孔進行培養。待細胞貼壁生長后，分別于第0、1、2、3 日在每孔培養基中加入10 μL的CCK-8試劑，孵育2 h后，檢測每孔450 nm 波長處的吸光度值［D（450 nm）］。并根據標準曲線計算對應細胞數，繪制增殖曲線。

1.7 平板克隆實驗

將對照組細胞和敲低組細胞按照250 個/孔種于24 孔板中。每日觀察細胞狀態，3～4 d 后進行細胞換液，培養10～14 d。撤去每孔培養基，PBS 清洗2 次。每孔加入預冷甲醇固定15 min，棄甲醇，加入0.01%結晶紫溶液染色1 h。染色完成后用流水清洗，晾干，顯微鏡下觀察克隆，統計每組≥50 個細胞的細胞克隆數。

1.8 細胞周期及其相關蛋白檢測

將對照組細胞和敲低組細胞用胰酶消化，離心收集，部分用于后續蛋白檢測。部分加入PBS 清洗細胞，再次離心收集，加入終濃度為75%的無水乙醇混勻，?20 ℃下固定細胞過夜。細胞固定完成后，加入PBS 清洗細胞，2 000×g離心10 min，重復清洗、離心，加入5 μL 濃度為10 mg/mL 的RNA酶，37 ℃水浴30 min，室溫加入PI 染料，避光孵育15 min。用流式細胞儀檢測不同細胞周期的細胞占比并分析。

取前步驟所收集部分細胞沉淀，使用PBS重懸細胞，并按1∶1 加入等體積2×SDS 細胞裂解液充分裂解，105 ℃加熱5 min，冰浴5 min，重復3 次，12 000×g離心5 min。所得上清液為蛋白樣品，采用Western blotting 方法，使用P21 抗體、P53 抗體、cyclin D1抗體、cyclin E1抗體檢測相關蛋白水平。

1.9 細胞凋亡及其相關蛋白檢測

收集對照組和敲低組細胞培養基上清，用不含EDTA 的胰酶消化細胞。用收集的培養基上清終止胰酶消化，離心收集細胞，用PBS 清洗重懸細胞并計數，部分細胞用于后續蛋白檢測。每組各取5 萬～10 萬個細胞，1 000×g離心5 min，依次加入Annexin V-FITC結合液、Annexin V 染液和PI染色液，輕輕混勻細胞，室溫避光孵育10～20 min，用流式細胞儀進行檢測。

蛋白樣品制備如前所述，采用Western blotting 方法，使用PARP 抗體、Cleaved caspase3 抗體檢測相關蛋白水平。

1.10 統計學方法

使用FlowJo 10.4 軟件分析流式細胞儀檢測結果。使用GraphPad Prism 8 軟件進行統計學分析并繪制柱狀圖。定量資料用±s表示，2 組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TRMT61A 在肝癌組織樣本中的表達及其與預后的關系

通過生物信息學軟件分析發現，在TCGA數據庫中，相比于癌旁組織，TRMT61A在肝癌組織樣本中高表達（圖1A）。繪制患者生存曲線，結果顯示TRMT61A的表達與肝癌患者的預后呈明顯的負相關（圖1B）。

圖1 TRMT61A在肝癌組織樣本中的表達及其與預后的關系Fig 1 Expression of TRMT61A in hepatocellular carcinoma samples and its correlation with prognosis

2.2 穩定敲低TRMT61A肝癌細胞系的構建和驗證

Western blotting 及斑點印跡實驗結果顯示，在Huh7 和HepG2 細胞中，相比于NC 組，KD-1 組和KD-2 組細胞的TRMT61A 蛋白水平顯著下降（圖2A～D），總RNA 的m1A 修飾水平也明顯降低（圖2E、F）；相比于KD-2 組，KD-1 組細胞TRMT61A敲低效果更好，m1A 修飾水平更低。因此，采用KD-1組作為敲低組細胞進行后續功能實驗。

圖2 穩定敲低TRMT61A肝癌細胞系Huh7和HepG2的構建和驗證Fig 2 Establishment and confirmation of stably-TRMT61A-knockdown Huh7 and HepG2 cells

2.3 敲低TRMT61A對肝癌細胞增殖能力的影響

CCK-8 檢測結果顯示，在2 株肝癌細胞中，相比于對照組，從實驗第2 日開始，敲低組細胞增殖情況明顯受到抑制（圖3A、B）。同樣，平板克隆實驗結果也顯示在Huh7 和HepG2 細胞中穩定敲低TRMT61A后，克隆形成數目均顯著降低，證實敲低TRMT61A可以顯著抑制肝癌細胞的增殖能力（圖3C～F）。

圖3 敲低TRMT61A對肝癌細胞增殖功能的影響Fig 3 Effects of TRMT61A knockdown on proliferation of Huh7 and HepG2 cells

2.4 敲低TRMT61A對肝癌細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，在Huh7（圖4A、B）和HepG2（圖4C、D）細胞中，相比于對照組，穩定敲低TRMT61A后細胞處于G0/G1 期的比例均顯著上升，其中Huh7 細胞敲低組處于S 期的細胞占比顯著下降，表明細胞出現了顯著的G0/G1 周期阻滯。

圖4 敲低TRMT61A對肝癌細胞周期的影響Fig 4 Effects of TRMT61A knockdown on cell cycle of Huh7 and HepG2 cells

2.5 敲低TRMT61A對肝癌細胞調控細胞周期相關蛋白表達的影響

通過Western blotting 檢測細胞周期相關蛋白水平并對結果進行灰度掃描分析發現，在Huh7 和HepG2細胞中，與對照組相比，敲低組細胞P21 蛋白水平均明顯上升，cyclin D1 蛋白水平明顯下降，而2 組細胞P53 和cyclin E1 蛋白水平的差異無統計學意義（圖5）。

圖5 敲低TRMT61A對肝癌細胞調控細胞周期相關蛋白表達的影響Fig 5 Effects of TRMT61A knockdown on cell cycle-related protein levels in Huh7 and HepG2 cells

2.6 敲低TRMT61A對肝癌細胞凋亡的影響

對Huh7 和HepG2 細胞進行Annexin V/PI 共染色后，通過流式細胞儀分析發現Huh7 細胞和HepG2 細胞中，相比于對照組，敲低組細胞中處于早期凋亡（Annexin V+/PI?，右下象限）的細胞占比和晚期凋亡（Annexin V+/PI+，右上象限）的細胞占比均升高（圖6A～D）。Western blotting 結 果 表 明，在Huh7 和HepG2細胞中，相比于對照組，敲低組細胞剪切活化caspase3蛋白水平均升高（圖6E～G）。

圖6 敲低TRMT61A對Huh7和HepG2細胞凋亡的影響Fig 6 Effects of TRMT61A knockdown on cell apoptosis in Huh7 cells and HepG2 cells

3 討論

肝細胞肝癌是一種惡性程度高、早期不易診斷的原發性肝臟腫瘤，近年來新輔助治療、免疫治療與轉化治療的臨床研究為肝細胞肝癌的治療提供了新的思路［11-12］。然而，肝細胞肝癌潛在的特定診斷標志物與治療靶點仍然需要更深入的研究。

m1A 修飾是一種RNA 甲基化修飾，研究表明m1A 修飾可參與調控多種生命活動［13］。在tRNA 上的第58 位氮原子是高度保守且重要的m1A 修飾位點，TRMT61A 作為m1A58 甲基轉移酶的催化亞基，其活性與tRNA 結構穩定性以及蛋白翻譯進程有密切關系，可影響人體多種病理生理學過程［14-16］。但關于m1A 修飾在肝癌細胞功能中的作用，尚未見報道。

本研究為了探究m1A修飾在肝癌細胞功能中的作用，首先構建了穩定敲低TRMT61A的2 株肝癌細胞，即Huh7 和HepG2，驗證結果發現敲低組細胞總RNA的m1A修飾水平明顯下降。然后，將對照組與敲低組細胞進行細胞功能實驗，探究敲低TRMT61A對肝癌細胞功能的作用及其機制。結果表明，在Huh7 和HepG2細胞中，相比于對照組，敲低組細胞增殖能力明顯減弱。進一步通過檢測細胞周期和相關蛋白表達發現，敲低TRMT61A后肝癌細胞P21 蛋白水平上調，cyclin D1 蛋白水平下降，細胞發生G0/G1 周期阻滯；另外，我們發現敲低TRMT61A可上調肝癌細胞內剪切活化的caspase3，并誘導肝癌細胞發生凋亡。

近年來，越來越多的研究發現異常的m1A修飾與多種腫瘤相關：TRMT61A與生殖細胞腫瘤患者預后有關［17］；m1A 去甲基化酶ALKBH3的異常表達與卵巢癌和乳腺癌的侵襲［18］、尿路上皮癌的進展［19］有密切聯系。這些研究結果提示m1A修飾可能在腫瘤發生和發展過程中發揮調控作用，但m1A修飾具體的作用靶點仍需要更深入的研究。除了tRNA 外，在mRNA、rRNA 上都有m1A 修飾的分布［20］。雖然m1A修飾在mRNA 上的豐度不如tRNA，但tRNA 的甲基化酶可以識別mRNA 上含有類似tRNA 模序“GUUCRA”的環狀結構（T-loop-structure），進而對mRNA 進行m1A 修飾［21］。有學者發現m1A 修飾的峰值富集于5'-UTR 和以起始密碼子為中心的50 nt 周圍區域［22］。這些區域更傾向于形成穩定的二級結構，可能進一步影響轉錄本的翻譯過程［23］。本研究發現在肝癌細胞中敲低TRMT61A表達后，細胞P21 和活化的caspase3 蛋白水平均升高，cyclin D1 蛋白水平有所下降，導致細胞增殖受到抑制，并發生凋亡。而m1A修飾是否直接作用于這些蛋白對應的轉錄本或攜帶特定氨基酸的tRNA 從而影響翻譯進程，仍然需要更深入的探索。

綜上所述，本研究發現m1A 修飾催化亞基TRMT61A表達降低可顯著抑制肝癌細胞的增殖能力，上調細胞P21蛋白并下調cyclin D1蛋白，使細胞發生周期阻滯；同時，可誘導肝癌細胞發生凋亡，進一步降低肝癌細胞存活率。該結果可為肝細胞肝癌發生和發展的機制研究提供新的思路。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻/Authors'Contributions

胡哲軒、張欣參與實驗設計；胡哲軒負責論文的寫作和修改；沃璐璐、李靜池、王嬌參與文獻檢索；周佽想負責研究方案核實；趙倩負責實驗指導與論文審閱。所有作者均閱讀并同意最終稿件的提交。

The study was designed by HU Zhexuan and ZHANG Xin . The manuscript was drafted and revised by HU Zhexuan . The document was searched by WO Lulu， LI Jingchi and WANG Jiao. The procedure was verified by ZHOU Cixiang.The research was guided by ZHAO Qian. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-16

·Accepted：2022-05-25

·Published online：2022-06-28