IgA腎病細胞模型中的炎癥表達及丙戊酸鈉的抗炎作用

戴 芹，王偉銘

1.復旦大學附屬徐匯醫院腎內科，上海 200031；2.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院腎內科，上海 200025

IgA腎病是以多聚體IgA1系膜區沉積、系膜細胞增殖、細胞外基質合成增加以及炎性細胞（包括巨噬細胞、單核細胞以及T細胞）浸潤為特征的自身免疫性疾病［1］。低糖基化IgA1（glycosylation deficiency IgA1，Gd-IgA1）在循環中增多，并在系膜區沉積是IgA 腎病的重要特征［2］。我們的既往研究［3］發現，IgA 腎病患者血漿Gd-IgA1 濃度越高，尿蛋白的量則越多。Gd-IgA1 分子的血清濃度與腎小球組織損害程度也密切相關［4］，IgA 腎病的病理表現亦和預后相關［5-7］。上述研究結果均提示血漿中Gd-IgA1 濃度與IgA腎病嚴重程度密切相關。

Gd-IgA1 通過自身積聚或者與自身抗體IgG 結合形成免疫復合物沉積在腎臟引發腎臟損傷［8］。系膜細胞受到損傷后會出現系膜細胞肥大、增殖和系膜基質擴張等生物學反應［9］。Gd-IgA1在系膜區沉積后繼發的炎癥、細胞增殖和細胞外基質的合成導致了IgA腎病的進展［10］。INOUE 等［11］通過ddY 小鼠研究發現：在不影響其血清IgA 濃度的情況下，抑制其腎組織中的炎癥可以延緩IgA 腎病的纖維化，改善IgA 腎病的預后。

本研究通過體外IgA 腎病細胞模型，應用人炎癥因子蛋白芯片檢測系膜細胞培養上清液中的炎癥因子表達，并用組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylation，HDAC）抑制劑丙戊酸鈉（sodium valproate，VPA）進行干預，觀察其在IgA 腎病細胞模型中的抗細胞增殖和抗炎作用，希冀從表觀遺傳學角度為防治IgA 腎病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞

人系膜細胞（human renal mesangial cells，HMCs）購于ScienCell研究實驗室（美國）。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 Jacalin/Agarose IgA1（Sigma，美國），丙戊酸鈉（Sigma，美國），人炎癥因子抗體芯片3 （AAH-INF-GS3-16；Raybiotech，美國），βactin rabbit mAb （HRP conjugate；CST，美 國），HDAC1（mouse monoclonal；CST，美國），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（ANOGEN，加拿大），其他常規試劑均為進口或國產分析純產品。

1.2.2 主要儀器 超凈臺（1300系列A2；Thermo公司，美國）；細胞培養箱（D-63450 Hanau；Heraeus公司，美國）；倒置相差顯微鏡（XSZ-D2；重慶光學儀器廠）；STS-2 型脫色搖床（上海斯特分析儀器有限公司）；低溫超速離心機（Eppendorf 公司，德國）等。

1.3 方法

1.3.1 親和層析法分離健康對照和IgA腎病患者中的IgA1 按照產品說明書操作，具體細節可參照我們的既往研究［12］。

1.3.2 細胞培養

（1）細胞的干預方法 將狀態良好的HMCs按照1×105個/孔均勻種在6孔板或10 cm培養皿內。觀察細胞長至80%～90%融合時，加入含1%FBS的DMEM培養液，培養12 h 后，分別加入不同類型的IgA1 及同體積的PBS（對照組），或者VPA 預處理1 h。24 h 后收集培養上清液至無菌EP 管中?80 ℃保存待用。細胞用胰酶消化后PBS液洗2次，然后提取總蛋白。

（2）MTT 細胞增殖實驗 收集對數期細胞，調整細胞懸液密度為104～105個/mL，布板前反復吹打細胞懸液，盡可能使細胞均勻，以100 μL/孔加入細胞懸液，邊緣孔用無菌PBS 100 μL/孔填充。5%CO2、37 ℃孵育，至細胞貼壁后吸棄含10%FBS的DMEM，重新加入含有不同干預成分的1%FBS 的DMEM 培養液，同時設置調零孔、對照孔，設5 個復孔。5%CO2、37 ℃孵育20 h。每孔加入10 μL MTT 溶液，繼續培養4 h。終止培養，小心吸棄孔內培養液。每孔加入150 μL MTT 溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶標儀570 nm 處測量各孔的吸光度值。

1.3.3 AAH-INF-GS3-16 芯片操作流程 本實驗共分為5 組： N-IgA1 組、 N-aIgA1 組、 P-IgA1 組、P-aIgA1以及無干預成分的僅含同體積PBS的對照組。玻片芯片完全干燥，加樣，封閉，孵育1 h；按操作說明清洗芯片；每孔加入80 μL 配置好的生物素標記抗體（16 孔）；室溫2 h；清洗后每孔加入70 μL 的1 500倍稀釋的熒光劑?鏈霉親和素，避光密封4 ℃過夜孵育。第2 日清洗芯片，拆除后再次清洗；放入離心機，甩干液體。用芯片掃描儀GenePix 4000B Microarray Scanner 掃描信號（掃描參數：PMT，650；波長532 nm；分辨率10 μm）。

1.3.4 免疫印跡法 HMCs 在RIPA 緩沖液中裂解，提取總蛋白。蛋白質定量后，以10 μg 蛋白上樣量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳分離，將蛋白轉移至PVDF 膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后，加入一抗，4 ℃過夜孵育；洗膜10 min，3 次；加HRP 標記的二抗（1∶2 000），37 ℃孵育1 h；洗膜10 min，3 次。顯影：用Image reader LAS-4000 程序顯影拍攝。圖像分析：Image pro plus 圖像分析軟件處理數據。

1.3.5 ELISA法檢測細胞培養液中TNF-α的表達

將提取的培養上清液按照試劑盒的說明書調節濃度，設立空白對照孔、陽性對照孔及樣品檢測孔，依次加入一抗、二抗，最后顯色，觀察到樣本孔及標準品孔變藍，每孔加入50 μL 終止液終止反應，在酶標儀450 nm波長處讀各孔的吸光度值。

1.4 統計學方法

用SPSS 16.0 軟件進行統計學分析，GraphPad Prism 6.0作圖。多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同IgA1 干預系膜細胞后培養上清液中炎癥因子的表達

2.1.1 人炎癥因子蛋白芯片的結果 如圖1 所示：P-aIgA1組蛋白芯片中有多個蛋白顯著高表達。

圖1 蛋白芯片檢測不同IgA1干預HMCs后培養上清液中炎癥因子的表達Fig 1 Expression of inflammatory factor in cultured HMCs supernatant induced by different IgA1s

2.1.2 蛋白芯片結果統計分析 如圖2所示，與對照組比較，P-aIgA1 組HMCs 培養上清液中白介素-6 可溶性受體（interleukin-6 soluble receptor，IL-6sR）、受激活調節的正常T 細胞表達和分泌因子（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES）、金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）、金屬蛋白酶組織抑制因子2 （tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP2）、TNF-α 和腫瘤壞死因子Ⅱ型受體（tumor necrosis factor type Ⅱreceptor，TNFRⅡ）的表達水平均顯著上調（均P<0.01），分別為對照組的34 倍、124 倍、269 倍、100 倍、1.6 倍以 及52 倍；N-aIgA1、P-IgA1、P-aIgA1 都 能 促 進TIMP2的表達，差異均有統計學意義（均P<0.01）。

圖2 人炎癥因子蛋白芯片的統計分析Fig 2 Statistical chart of the array

2.2 不同成分的IgA1對系膜細胞增殖的影響

分別用含N-IgA1、P-IgA1、P-aIgA1 的培養基培養HMCs 24 h后（以同體積的PBS干預HMCs為對照組），用MTT法觀察HMCs的增殖程度。結果（圖3）顯示：與對照組相比，N-IgA1 組對HMCs 的增殖無顯著的影響，P-IgA1 及P-aIgA1 都能顯著促進HMCs的增殖（P=0.045 和P=0.003）；與N-IgA1 組相比，P-aIgA1 組HMCs 出現了顯著的增殖，差異有統計學意義（P=0.036）。

圖3 不同的IgA1對系膜細胞增殖的影響Fig 3 Effects of different IgA1s on the proliferation of mesangial cell

2.3 不同濃度的P-aIgA1對系膜細胞增殖的影響

分別用含25、50、100 和250 μg/mL P-aIgA1 的培養基培養HMCs（以同體積的PBS 干預HMCs 為對照組），觀察其對HMCs 增殖的影響。如圖4 所示，25 μg/mL 的P-aIgA1 就可以明顯地促進HMCs的增殖，50 μg/mL 和100 μg/mL 的濃度促進HMCs的增殖程度相似，250 μg/mL 促進HMCs 的增殖程度最高。

圖4 不同濃度的P-aIgA1對系膜細胞增殖的影響Fig 4 Effects of different concentrations of P-aIgA1 on the proliferation of mesangial cell

2.4 不同IgA1對HMCs中HDAC1蛋白的影響

采用Western blotting 方法檢測了不同IgA1 對系膜細胞HDAC1 蛋白的影響，以同體積PBS 干預的HMCs 為對照組（圖5）。結果顯示：與對照組相比，P-aIgA1、P-IgA1 及N-IgA1 均不同程度地增加了HMCs 中HDAC1 的表達，分別是對照組的（8.64±0.59） 倍、（5.42±0.16） 倍 和（5.87±0.58） 倍；與N-IgA1 組相比，P-aIgA1 組顯著增加了HDAC1 表達，差異有統計學意義（P=0.021）。

圖5 不同IgA1對系膜細胞HDAC1蛋白的影響Fig 5 Effects of different IgA1s on HDAC1 protein in HMCs

2.5 VPA對系膜細胞增殖及分泌TNF-α蛋白的影響

2.5.1 VPA 對P-aIgA1 引起的系膜細胞增殖的抑制作用 以同體積的PBS 干預HMCs 為對照組，用50 μg/mL 的P-aIgA1 作用HMCs 前分別用50、100、200、400、1 000 μg/mL的VPA進行預處理1 h，觀察其對HMCs 增殖的抑制作用（圖6）。與對照組相比，50 μg/mL 的P-aIgA1 顯著促進了HMCs 的增殖（P=0.009）。低濃度（50～200 μg/mL）的VPA 抑制HMCs增殖的作用不明顯，400 μg/mL的VPA 出現了顯著的抑制作用（P=0.028），1 000 μg/mL 的VPA 出現了過度抑制（P=0.002）。

圖6 不同濃度的VPA對P-aIgA1作用的HMCs增殖的影響Fig 6 Effects of different concentrations of VPA on the proliferation of mesangial cell induced by P-aIgA1

2.5.2 VPA 對系膜細胞分泌TNF-α 蛋白的影響 分別用N-IgA1、P-IgA1、P-aIgA1 及P-aIgA1+VPA 作用HMCs 24 h 后（以同體積的PBS 干預HMCs 為對照組），用ELISA法觀察HMCs細胞培養上清液中TNF-α蛋白表達（圖7）。結果顯示：與對照組相比，P-aIgA1 組TNF-α 蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P=0.001）；與P-aIgA1 組比較，P-aIgA1+VPA組TNF-α 蛋白表達水平顯著下降，差異有統計學意義（P=0.035），表明VPA 可以抑制P-aIgA1 誘導的HMCs細胞培養上清液中TNF-α蛋白的表達。

圖7 不同干預成分對HMCs培養上清液TNF-α 蛋白表達水平的影響Fig 7 Effects of different stimulators on TNF-α protein in HMCs cultured supernatant

3 討論

IgA腎病是全球活檢報告中最常見的原發性腎小球腎炎［13］，好發于年輕人，在診斷后20年內，有30%～40%的患者發展為終末期腎病［14-15］。然而，目前臨床上卻沒有有效的治療手段能夠阻止疾病的進展。

腎組織中系膜細胞增殖及局部的炎癥是促進IgA腎病疾病進展的重要環節。本研究通過體外IgA 腎病模型探討含有Gd-IgA1復合物沉積腎臟后引發的系膜細胞增殖及炎癥反應。應用人炎癥因子蛋白芯片觀察不同成分的IgA1 對人系膜細胞分泌炎癥因子表達的影響。結果顯示：與對照組比較，P-aIgA1 組HMCs培養上清液中IL-6sR、RANTES、TIMP1、TIMP2、TNF-α 和TNFRⅡ的表達水平顯著上調。上述結果表明P-aIgA1最能促進系膜細胞釋放促炎癥因子。

為了進一步研究不同成分的IgA1 對系膜細胞增殖的影響，我們分別用N-IgA1、P-IgA1和P-aIgA1作用于HMCs 24 h 后，用MTT 法觀察HMCs 的增殖程度。結果顯示：與對照組相比，N-IgA1 組對HMCs的增殖無顯著的影響，P-aIgA1 及P-IgA1 組能夠顯著促進HMCs 增殖。接著我們分別用不同濃度的P-aIgA1 作用HMCs，觀察其對HMCs 增殖的不同影響。結果顯示：25 μg/mL 的P-aIgA1 就可以明顯地促進HMCs 的增殖，50 和100 μg/mL 的濃度促進HMCs的增殖程度相似，250 μg/mL 促進HMCs 的增殖程度最高，顯示了P-aIgA1 促進HMCs 增殖呈濃度依賴。上述研究結果表明P-aIgA1 能顯著促進系膜細胞釋放促炎癥因子和系膜細胞增殖，但是其內在機制并不清楚。

組蛋白乙酰化修飾是表觀遺傳學的重要作用機制之一，組蛋白乙酰化和去乙酰化修飾在腎臟的發育和腎臟疾病的發生過程中起著多重作用［14，16-17］。我們前期研究［18］已發現：IgA腎病患者腎組織中HDAC1顯著上調，H3Ac蛋白水平明顯下調。為了進一步研究體外IgA腎病模型中組蛋白乙酰化情況，我們用不同成分的IgA1干預HMCs，觀察其對系膜細胞中HDAC1蛋白的影響。結果顯示：與對照組相比，N-IgA1、P-IgA1、P-aIgA1刺激HMCs后均不同程度地增加了HMCs的HDAC1表達；與N-IgA1 組相比，P-aIgA1 組更顯著地增加了HDAC1蛋白。由此可見，HDAC1在P-aIgA1干預系膜細胞的過程中顯著升高，參與了系膜細胞增殖和炎癥反應。

HDACs 蛋白是細胞內最重要的蛋白之一，它能廣泛地調節細胞的功能［19］。HDAC 抑制劑如VPA 的研究，正在成為一個有吸引力的領域。VPA抗細胞增殖、抗炎及抗纖維化作用也日益受到關注。研究發現，VPA可通過激活線粒體固有的凋亡途徑誘導細胞凋亡［20］；可以抑制膠質母細胞瘤中神經膠質瘤干細胞的增殖和運動［21］。我們在前期研究中還發現：VPA 可以顯著下調體外IgA 腎病模型中HDAC1 的表達，上調H3Ac 的表達，顯著減輕細胞外基質的合成［12］。

本研究繼續觀察了不同濃度VPA 對HMCs 分泌TNF-α 及HMCs 增殖的影響。本研究應用P-aIgA1 顯著促進HMCs 增殖，然后分別用不同濃度的VPA 進行干預，結果發現：400 μg/mL 出現了顯著的抑制細胞增殖作用。同時還發現，VPA 也顯著抑制了P-aIgA1 誘導的TNF-α 的表達。有研究表明，VPA 不僅可以抑制TNF-α 的表達，還可以抑制NF-κB 和IL-6等炎癥信號通路［22］。

綜上所述，P-aIgA1 能顯著促進系膜細胞釋放促炎癥因子和系膜細胞增殖，且促細胞增殖作用呈濃度依賴。體外IgA 腎病細胞模型中存在乙酰化修飾異常，其參與了系膜細胞增殖和炎癥反應。HDAC抑制劑VPA 可以部分逆轉上述反應，提示其在疾病干預方面有一定應用前景，可為從表觀遺傳學角度防治IgA腎病提供新的思路。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究遵守《赫爾辛基宣言》的宗旨，并經上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院研究倫理委員會批準（No［2010］29）。研究對象或其親屬已經簽署知情同意書。

This study was conducted in accordance with theDeclaration of Helsinki， and was reviewed and approved by the Ethics Committee of Ruijin Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （No［2010］29）. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻/Authors'Contributions

戴芹、王偉銘參與實驗設計；戴芹參與論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by DAI Qin and WANG Weiming. The manuscript was drafted and revised by DAI Qin. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-01

·Accepted：2022-06-03

·Published online：2022-06-28