基于生物信息學分析CENPN在肝癌中的預后價值和作用機制①

周艷琳 劉 俊 李勇莉 李林玉 趙 冰 （新鄉醫學院三全學院，新鄉 453003）

肝細胞癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）是全球最常見的惡性腫瘤之一［1］。LIHC 的病死率在所有癌癥中排名第二，接受切除手術或消融術后五年內約有70%的復發率［2］。導致不良預后的主要原因是腫瘤轉移和術后復發［3］。越來越多的研究表明，mRNA 可作為癌癥預后的潛在生物標志［4-5］。有證據顯示，ANLN、ECT2、HMMR、KIF20A、NCAPG、PBK、RACGAP1 和 ZWINT 等 mRNA 均可作為肝癌診斷和治療的候選靶點，通過基因的異常表達或改變參與LIHC 的發生發展［6］。隨著生物信息技術的成熟，現已被廣泛用于分析LIHC 相關的差異表達基因和相關信號通路，以此提高LIHC 篩查和治療的概率［7］。然而，LIHC 具有較高的分子異質性，篩選出新的潛在LIHC 預后生物標志，對降低LIHC 患者病死率、改善預后和實現個體化靶向治療均有重要意義。著絲粒蛋白N（centromere protein N，CENPN）是著絲粒核小體相關復合物的成分，在激核蛋白組裝、有絲分裂進展和染色體分離中發揮核心作用［8］。然而，CENPN 在 LIHC 中的作用及機制研究尚不完全明確。本研究通過生物信息學方法分析CENPN 在LIHC 中的表達及其與預后的關系，并探討其調控LIHC 的可能機制，為LIHC 的臨床診治和預后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數據的獲取和篩選 基于TIMER2.0 數據庫（http：//timer. cistrome. org/）［9］通 過 Exploration 模塊下的Gene-DE 檢索CENPN 在TCGA 數據庫所有腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達。利用GEPIA2 數據庫（http：//gepia2. cancer-pku. cn/#index）［10］進一步驗證CENPN 在TCGA-GTEx-LIHC 中的表達。設定篩選條件為|Log2FC| Cutoff：1、P-value Cutoff：0.05、LIHC，Match TCGA normal and GTEx data，包括369例肝癌組織樣本和160例正常對照組織樣本。

1.2 CENPN 的表達與肝癌患者病理分期和預后相關性分析 基于GEPIA2.0數據庫分析了CENPN的表達與LIHC 患者病理分期和預后的相關性。通過CENPN 表達值的中位數將LIHC 患者分為高表達組與低表達組，根據CoxPH 模型，計算危險比（HR）和P值，并繪制生存曲線，包括總體生存期（overall survival，OS）曲線和無病生存期（disease free survival，RFS）曲線。利用Logistic回歸分析檢測CENPN表達與LIHC 患者臨床分期的相關性，P<0.05 為差異具有統計學意義。

1.3 LIHC 中與CENPN 共表達基因的篩選及功能富集分析 基于LinkedOmics 數據庫（http：//www.Linkedomics.org）［11］分析 CENPN 在 TCGA LIHC 患者組織共表達基因情況，包括371 例肝癌患者，檢索LIHC 中CENPN 相關的上調基因和下調基因。篩選條件為：LIHC、RNAseq、CENPN、RNAseq，Spearman檢驗進行數據處理，P<0.05 為差異具有統計學意義，選擇共表達差異基因最緊密的前50個基因制作熱圖。將篩選的與CENPN 共表達差異基因最緊密的前 500 個基因載入 DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf. gov/）［12］，以 人 源 基 因 為 背 景 ，進 行 GO 和KEGG 通路富集分析。GO 分析主要用于基因注釋，包括生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular func?tion，MF）。基于 KEGG 數據庫（https：//www. kegg.jp/）［13］，在 KEGG Maper 模塊下的 Search&Color Path?way 中進行檢索，將Top 500 關聯緊密的基因載入對應框，生成路線圖，關鍵共表達基因在細胞周期中的位置顯示為紅色。

1.4 CENPN表達與甲基化的關系 通過cBioPortal數據庫（http：//www. cbioportal. org/）［14］分析 CENPN表達在5 組LIHC 樣本中基因組水平的變化。共1 070 例肝癌患者，篩選條件為：拷貝數變異（copy number alterations，CNA）和突變（mutations，Mut），在Plot 模塊通過Spearman 和Pearson 檢驗分析CENPN表達與甲基化的相關性。

1.5 CENPN 與腫瘤免疫細胞浸潤的關系 利用TIMER 數 據 庫（https：//cistrome. shinyapps. io/tim?er/）［15］，通過 Gene 模塊檢索分析 CENPN 表達與各種腫瘤浸潤免疫細胞的相關性，包括B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、單核細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞，Spearman 檢驗處理數據，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CENPN 在泛癌中的表達 基于TIMER2.0 數據庫分析CENPN 在TCGA 39種腫瘤中的表達情況，結果顯示，CENPN 在乳腺癌、食道癌、宮頸癌、LIHC等20 種腫瘤中均顯著高表達。在TCGA-LIHC 中，相較于癌旁組織（n=50），CENPN 在 LIHC 組織（n=371）中的表達量顯著增多，差異有統計學意義（P<0.001）。

2.2 CENPN 在LIHC 組織中的表達及病理分期分析 基于GEPIA2 數據庫進一步驗證CENPN 在TCGA-GTEx 529 例 LIHC 中 的 表 達 ，包 括 369 例LIHC 樣本和160 例正常對照樣本，比較LIHC 癌組織和正常組織中CENPN 的表達情況，結果顯示，CENPN 在LIHC 中的表達量顯著高于正常組織（圖2A），差異具有統計學意義（P<0.05）。進一步基于GEPIA2 數據庫分析CENPN 與LIHC 腫瘤分期的關系，結果顯示，隨著腫瘤分期的進展，CENPN 表達量明顯升高［F=6.98，Pr（>F）=0.000 143］，差異具有統計學意義（圖2B）。提示CENPN 在LIHC 中高表達，可作為LIHC患者晚期預后不良指標之一。

圖1 CENPN在TCGA 各種腫瘤組織中的表達Fig.1 Expressions of CENPN in various tumor tissues in TCGA

圖2 CENPN 在TCGA-GTEx 肝癌組織表達及病理分期的分析Fig.2 Analysis of expression and pathological stage of CENPN in TCGA-GTEx LIHC tissue

2.3 CENPN 表達與LIHC 患者生存期的關系 基于GEPIA2數據庫，可得到各182例CENPN高表達與低表達患者的OS 曲線和RFS曲線。結果顯示，LIHC患者中CENPN 高表達的患者［logrankP=0.003 1，HR（high）=1.7，P（HR）=0.003 5］總體生存期明顯低于低表達患者（圖3A）；在LIHC 患者中CENPN 高表達患者［logrankP=0.000 45，HR（high）=1.7，P（HR）=5e-04］RFS 明顯低于低表達患者（圖3B）。表明CENPN 高表達與 LIHC 患者 OS 和 RFS 均存在相關性，提示CENPN 可作為肝癌患者的預后不良指標之一。

圖3 CENPN的表達與肝癌患者生存期的關系Fig.3 Relationship between CENPN expression and sur?vival in LIHC patients

2.4 CENPN 在LIHC 中的共表達基因篩選及功能富集分析 基于LinkedOmics數據庫分析CENPN 在LIHC 中的共表達基因，篩選出差異顯著（P<0.05）且關聯最緊密的Top 50 基因繪制熱圖（圖4）。結果顯示，在LIHC 中與CENPN 表達關聯緊密的基因有TK1、C16orf61、KARS、COX4NB、COG4 等。將差異顯著且關聯最緊密的Top 500基因載入DAVID 數據庫進行GO 分析和KEGG 分析，結果顯示，這些關聯基因主要富集于細胞裂解、DNA 復制、G1/S 期、G2/M期、核質、蛋白質結合等生物過程（表1），KEGG分析主要富集于細胞周期、DNA 復制、P53 信號等通路（表2），以細胞周期通路的關聯度（count=26）和差異性（P=1.02E-15，FDR=1.79E-13）最明顯。為進一步探究CENPN 及關聯基因在細胞周期通路中的作用和相關基因在細胞周期中的位置關系，將細胞周期通路中的CENPN 相關基因帶入與KEGG 通路相關的網站生成路線圖（圖5），并標出通路中對應基因的相關位置（紅色標記），大部分基因與細胞周期的 G1/S 期和 G2/M 期有關。提示 CENPN 在 LIHC 中可能通過調控相關分子影響生物合成，改變細胞周期等相關通路，進而調控LIHC的發生、發展。

圖4 CENPN在肝癌中差異共表達Top 50基因Fig.4 CENPN differently co-expressed Top 50 genes in LIHC

圖5 CENPN共表達基因在細胞周期中的位置關系Fig.5 Location relationship of CENPN co-expression genes in cell cycle

表1 CENPN差異性共表達基因的GO分析Tab.1 GO analysis of CENPN differently co-expressed genes

表2 CENPN差異共表達基因的KEGG分析Tab.2 KEGG analysis of CENPN differently co-expressed genes

2.5 CENPN 的表達與甲基化的關系 通過cBio?Portal 數據庫分析CENPN 的基因組水平變化，結果顯示，在選取的5 組LIHC 研究中，包括1 070 例LIHC樣本，CENPN的表達與甲基化呈負相關（圖6），差異有統計學意義（Spearmanr=?0.28，P=3.23e-8；Pearsonr=?0.23，P=9.395e-6）。提示CENPN 在LIHC中的高表達可能受甲基化修飾調控。

圖6 CENPN的表達與甲基化的關系Fig.6 Relationship between CENPN expression and methylation

2.6 CENPN的表達與免疫細胞浸潤的關系 TIMER數據庫分析發現，TCGA-肝癌中CENPN 表達水平與6種免疫細胞浸潤水平均呈顯著正相關（圖7），包括B細胞（r=0.362，P=4.11e-12）、CD8+T細胞（r=0.291，P=4.09e-08）、CD4+T 細胞（r=0.13，P=1.58e-02）、巨噬細胞（r=0.291，P=4.28e-08）、中性粒細胞（r=0.275，P=2.04e-07）和樹突狀細胞（r=0.288，P=6.70e-08），差異均有統計學意義。其中與B 細胞關系最密切，差異性最顯著。表明CENPN 可能通過影響免疫細胞浸潤調控LIHC的發生和發展。

圖7 在TCGA-肝癌中CENPN表達與免疫細胞浸潤的關系Fig.7 Relationship between CENPN expression and immune cell infiltration in TCGA-LIHC

3 討論

LIHC是全球最常見的惡性腫瘤之一，病死率排名第二，篩選出新的LIHC 預后標志物對降低LIHC患者病死率，改善預后和實現個體化靶向治療均有重要意義。著絲粒蛋白（centromere protein，CENP）包含 18 個亞型，有 CENP-A/C/H/I/K/M/T/W/N/L 等，通過紡錘體微管調節染色體DNA 分離，因此，CENP在細胞周期調控和染色體分離過程中極為重要［16-17］。LIU 等［18］研究發現 TK1、CCNB2 和 NUSAP1在LIHC中過表達，與LIHC的侵襲、轉移及預后等密切相關。ZHANG 等［19］研究顯示，KARS 通過細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡機制介導LIHC 的發展。SHI 等［20］研究顯示，CDC20 通過介導 PHD3 的降解，穩定HIF-1α 的表達，以此促進LIHC 的發生與發展。本研究發現，CENPN 在LIHC 中的表達與TK1、CCNB2、KARS、CDC20 等均顯著相關，推測 CENPN可能也參與了LIHC 的發生發展。然而CENPN 在LIHC中的調控機制尚不清楚。

本研究通過生物信息學對LIHC 的多個數據庫數據進行分析。基于TIMER2.0 數據庫，分析CENPN 在TCGA 各種腫瘤中的表達情況，結果顯示，CENPN 在TCGA 20 種腫瘤中均高表達，在LIHC中的表達差異具有統計學意義（P<0.001）。基于GEPIA2 數據庫進一步驗證CENPN 在LIHC 中的表達，CENPN 在369 例LIHC 中的表達量顯著高于正常組織，與TIMER2.0數據相符。隨后，基于GEPIA2數據庫分析CENPN 表達與LIHC患者病理分期及預后的相關性，結果顯示CENPN 低表達患者OS 和RFS 均較高，CENPN 可作為判斷LIHC 預后的指標；CENPN 隨著腫瘤分期的進展表現為升高趨勢，由于StageⅣ的患者只有4 例，因此StageⅣ的數據可能存在一定的統計學偏差。以上結果均提示，CENPN 在LIHC 中高表達，可能作為LIHC 預后不良的標志物之一，為LIHC的個體化診療提供了新的靶點。

為了進一步探究CENPN 在LIHC 發生發展中的下游調控機制。課題組基于LinkedOmics 數據庫分析CENPN 在TCGA-LIHC 表達的互作基因，結果顯示，與CENPN 存在互作的差異表達基因有TK1、C16orf61、KARS、CDC20 等，這些基因均參與 LIHC的發展，與既往研究部分相符［18-20］，提示 CENPN 在LIHC 發展中存在復雜的分子互作關系。本研究基于DAVID 數據庫對Top 500的差異性共表達基因進行GO 和KEGG 富集分析，結果顯示，這些共表達基因主要富集于細胞周期、DNA 復制、P53信號通路等過程，可視化參與細胞周期調控LIHC 發展的互作基因位置關系發現，大部分差異基因與細胞周期的S 期和G2/M 期有關，提示CENPN 主要通過細胞周期通路調控 LIHC 發展。OKA 等［21］研究發現，CENPN在口腔鱗癌中高表達，通過阻滯細胞周期G1影響細胞增殖，參與口腔鱗癌發生。CHITTORI 等［22］研究發現，CENPN 與 CENPA、CENPC 相互作用，影響著絲粒核小體結構，調控染色體和有絲分裂中與紡錘體微管相連的動脈管的組裝和染色體分離，進而改變細胞周期。WANG 等［23］通過 GSEA 數據庫預測CENPN 相關基因主要富集于 P53、Rb1、E2F 靶點等通路，并在 HepG2 和 Huh7 兩種 LIHC 細胞系中驗證CENPN 可靶向p21-CDK2/cyclin E、p27-CDK4/cyclin D和Rb/E2F1信號通路調控LIHC進展，然而并未顯示CENPN與腫瘤微環境的關系。本研究基于TIMER數據庫分析CENPN 表達與腫瘤浸潤免疫細胞的關系，結果顯示，CENPN 的表達與 B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞6 種腫瘤免疫細胞變化均相關，尤其與B 細胞的相關系數和差異性最為顯著（r=0.362，P=4.11e-12），提示調控腫瘤免疫反應相關通路可能是CENPN 促進LIHC 進展的重要機制之一，可能與LIHC 顯著的免疫炎癥驅動有關。CENPN 在免疫調控中的具體作用，以及是否能夠作為免疫治療的生物標志物或聯合治療靶點有待進一步研究。

最后，本研究探究了CENPN 在LIHC 中高表達的上游機制。腫瘤的發生通常與基因的異常表達或改變密切相關，基因擴增情況或甲基化狀態或上游非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）的調控均可引起基因的異常表達，進而加速腫瘤進程。本研究通過cBioPortal 數據庫分析CENPN 在基因組水平的變化，結果顯示，在選取的1 070 例LIHC 樣本中不發生基因拷貝數擴增，只有0.3%的LIHC 患者發生CENPN 深度缺失，提示CENPN 在LIHC 中的高表達不是由基因拷貝數擴增引起的；進一步分析CENPN 在LIHC 中表達與甲基化的關系，結果顯示，CENPN 的表達與甲基化呈負相關，有研究顯示DNA甲基化是一種表觀遺傳調控機制［24］，通過甲基轉移酶將甲基（CH3）基團修飾到特定DNA 核酸位點，從而影響基因表達，推測CENPN 可能通過甲基化修飾改變其在LIHC 中的表達，進而參與LIHC 的發生發展。本研究只進行了CENPN 在基因拷貝數擴增和甲基化方面的研究，并未篩選其他調控CENPN 表達的原因，下一步將篩選各種ncRNA（miRNA、circ-RNA等）對CENPN表達的影響。

綜上所述，本研究明確了CENPN 在多種腫瘤中的表達情況，其高表達與LIHC 不良預后有關，可作為LIHC 新的潛在預后標志物和靶向治療的潛在分子靶點。CENPN 在LIHC 中的高表達與甲基化修飾有關，還可能通過調節腫瘤免疫微環境，參與細胞周期調控的相關通路從而影響LIHC 的發生、發展。為了進一步闡明CENPN 在LIHC 中的功能和作用，還需要進行分子生物學實驗以驗證和探究。