TFEB在海藻糖改善哮喘小鼠肺臟炎癥中的作用研究

謝貴會 李 冰 蔡美娟 趙小兵 （棗莊市婦幼保健院兒一科，棗莊 277100）

海藻糖為兩分子D-吡喃葡萄糖的異頭碳原子上的半縮醛羥基間去水縮合而成的非還原性雙糖，存在于霉菌、藻類、干酵母、麥角等，由較低級的生物如酵母、細菌、昆蟲和植物合成，也可由人工合成，但在哺乳動物中無法合成。大量實驗結(jié)果表明，不同應(yīng)力條件下，海藻糖可穩(wěn)定生物膜和蛋白結(jié)構(gòu)，有效保護細胞膜和蛋白結(jié)構(gòu)功能，使生物體在異常情況下，如高溫脫水、冷凍時，仍保持細胞活性，防止細胞因失水導(dǎo)致的損傷［1-2］。低等生物（如酵母）中，海藻糖可迅速積累，使其在干旱、熱休克、氧化應(yīng)激和蛋白聚集中仍能存活［3］。海藻糖也能保護哺乳動物細胞免受應(yīng)激損傷，海藻糖賦予細胞較高保水能力，從而保護細胞內(nèi)細胞器不受水合/脫水作用破壞［4-5］。因此，海藻糖是一種潛在的有益化合物。研究發(fā)現(xiàn)海藻糖具有抗氧化功能，并顯著降低細胞內(nèi)大量未折疊或錯誤折疊蛋白積累，促進β-淀粉樣蛋白清除而在神經(jīng)退行性疾病小鼠模型中發(fā)揮有益作用，改善阿爾茨海默病［6-8］。最新研究表明，海藻糖可通過促進細胞內(nèi)脂滴清除減少肝脂肪變性，促進自噬改善肝損傷［9］。但炎癥應(yīng)激狀態(tài)下海藻糖的作用尚未闡明。

哮喘又名支氣管哮喘，是由多種細胞及細胞組分（如肥大細胞、中性粒細胞等）參與的慢性氣道炎癥，常伴隨氣道反應(yīng)性增高，導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和（或）咳嗽等癥狀，多在夜間和（或）凌晨發(fā)生，此類癥狀常伴有廣泛而多變的氣流阻塞，且免疫支氣管哮喘作為最常見的慢性氣道疾病，患病率較高［10］。最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，50 991例調(diào)查人群中支氣管哮喘發(fā)病率為4.2%，其中并發(fā)氣道限制的支氣管哮喘達1.1%，年齡、吸煙、過敏等均可引發(fā)哮喘，因此探索哮喘的發(fā)病機制和尋找新的抗哮喘藥物刻不容緩［11-13］。本研究通過哮喘小鼠模型檢測小鼠肺臟炎癥變化，通過給予海藻糖研究海藻糖在哮喘相關(guān)氣道炎癥中的作用，并揭示海藻糖改善哮喘相關(guān)氣道炎癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡C57BL/6小鼠購自南京模式動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2019-0005，體質(zhì)量23~25 g，使用許可證號：SYXK（皖）2018-0032，飼養(yǎng)于SPF級動物房，23 ℃、50%濕度，晝夜周期為12 h。所有動物實驗均經(jīng)棗莊市婦幼保健院倫理委員會審批（IACUC 號：002-0023），嚴格按照實驗動物倫理和3R原則設(shè)計、實施動物實驗。

1.1.2 試劑與儀器 海藻糖（6138-23-4）、卵白蛋白（OVA，1405-69-2）購自美國Sigma；氫氧化鋁（HT-205）購自泰星新材料有限公司（中國）；IL-1（H002）、IL-4（H005）、IL-5（H006）、IL-13（H011）以及 IFN-γ（H025）和小鼠OVA 特異性 IgE（OVA-sIgE）試劑盒（H017）購自南京建成生物工程研究所（中國）；細胞核/質(zhì)蛋白分離試劑盒（78833）購自美國賽默飛；TFEB 抗體（13372-1-AP）、CD3 和CD4 熒光標記抗體（10021-1-AP、10031-1-AP）購自美國Proteintech；瑞氏染液（G1040）購自索萊寶（中國）；肺臟特異性腺相關(guān)病毒TFEB-ShRNA AAV9 及其對照病毒由上海漢恒生物有限公司（中國）構(gòu)建；超聲霧化器（JZ-8B）購自北京九州晟欣科技有限公司（中國）。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理 40 只C57BL/6 小鼠隨機分為對照組（C組）、哮喘組（AS組）、海藻糖低（TL組）、中（TM 組）、高劑量組（TH 組），每組 8 只，TL 組、TM 組和TH 組從致敏階段第1 天開始每天灌胃給予0.4、0.8、1.2 ml 質(zhì)量分數(shù)為5%的海藻糖溶液，C組給予等量生理鹽水，處理30 d。另取20 只C57BL/6 小鼠隨機分為Schamble組（S組）和shRNA組。

1.2.2 哮喘小鼠模型建立 在AS 組、TL 組、TM 組和 TH 組中構(gòu)建哮喘模型，第 0、10、20 天腹腔注射OVA 和氫氧化鋁混合液致敏小鼠，劑量為50 μg OVA 和2 mg 氫氧化鋁生理鹽水溶液，第30 天霧化吸入2%OVA 2 h，誘導(dǎo)小鼠哮喘狀態(tài)。C 組致敏階段腹腔注射等劑量氫氧化鋁混合液，激發(fā)階段采用生理鹽水霧化吸入作為對照。密切觀察小鼠行為狀態(tài)，判斷小鼠哮喘狀態(tài)，哮喘模型建立期間及模型建立結(jié)束后20 d 海藻糖組繼續(xù)給予海藻糖處理10 d。

1.2.3 標本采集

1.2.3.1 血清收集 2%OVA 霧化激發(fā)哮喘48 h后，2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，心尖取血，4 ℃、2 000 r/min 離心15 min，收集血清，-80 ℃保存用于后續(xù)檢測。

1.2.3.2 支氣管肺泡灌洗液和肺組織收集 分離暴露肺部，結(jié)扎左支氣管，靜脈留置針氣管插管，進入右支氣管，向其中反復(fù)抽注500 μl 預(yù)冷的PBS 緩沖液，回抽獲得約200 μl 支氣管肺泡灌洗，4 ℃、2 000 r/min 離心15 min，收集上清用于炎癥相關(guān)因子檢測，沉淀立即用于炎癥細胞包括嗜酸性細胞、中性粒細胞以及淋巴細胞計數(shù)。實驗結(jié)束后剪切左側(cè)肺組織，取約100 mg 置于4%多聚甲醛固定，其余部分-80 ℃保存用于后續(xù)檢測。

1.2.4 支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞計數(shù) 取100 μl 預(yù)冷的PBS 重懸支氣管肺泡灌洗液沉淀，涂片，干燥后進行玻片瑞氏染色，加入瑞氏染液30 min后PBS 緩沖液洗掉多余染液，光學(xué)顯微鏡下進行炎癥細胞分類計數(shù)，根據(jù)細胞形態(tài)（尤其是細胞核形態(tài)）統(tǒng)計各組嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞差異。

1.2.5 雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子濃度 根據(jù)試劑盒說明書檢測支氣管肺泡灌洗液上清中炎癥因子（IL-1、IL-4、IL-5、IL-12、IFN-γ）濃度：預(yù)先包被相應(yīng)捕獲抗體的包被微孔中依次加入標本、標準品、HRP 標記的檢測抗體，溫育并徹底洗滌，底物TMB 顯色（TMB 在過氧化物酶催化下轉(zhuǎn)化為藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化為黃色）。顏色深淺與炎癥因子濃度呈正相關(guān)，酶標儀測定450 nm處吸光度（OD）值，計算樣品濃度。

1.2.6 OVA-sIgE 試劑盒檢測小鼠肺泡灌洗液及血清中IgE 含量 酶標包被板上加入不同稀釋濃度的標準品及待測樣品，另設(shè)置空白對照孔（不加樣品及酶標試劑，其余操作相同），封板膜封板，37 ℃溫育30 min，揭掉封板膜，棄液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 s 后棄去，重復(fù) 5 次，拍干。50 μl/孔加入酶標試劑，空白孔除外，重復(fù)溫育洗滌步驟。50 μl/孔加入顯色劑A，再50 μl/孔加入顯色劑B5，振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，50 μl/孔加入終止液終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色），顯色，依次測量450 nm處各孔OD值。

1.2.7 肺臟CD4+T 淋巴細胞分離 采用膠原酶分離肺臟中單個核細胞，取各組肺臟組織1 000 mg，剪成小塊，Ⅳ型膠原酶消化3 h，反復(fù)捶打成單細胞懸液，Percoll 密度梯度離心獲得小鼠肺臟單個核細胞懸液，用CD3 和CD4 熒光標記抗體進行流式細胞分選，分選出CD3+CD4+T細胞用于后續(xù)檢測。

1.2.8 肺臟TFEB 干擾 構(gòu)建肺臟特異性腺相關(guān)病毒TFEB-shRNA AAV9，采用24G導(dǎo)管經(jīng)小鼠肺呼吸道遞送病毒液至氣管，1×1011pfu/只，最大程度特異性遞送，實現(xiàn)TFEB-shRNA AAV9 在肺臟的高效表達。C 組給予等劑量Scramble-shRNA AAV9，3 d后C組和TFEB干擾組均采用1.2.1和1.2.2方法給予海藻糖和模擬哮喘模型，海藻糖處理劑量為中劑量組，觀察TFEB干擾后海藻糖對哮喘改善的影響。

1.2.9 Western blot 肺臟在RIPA 裂解液中振蕩研磨勻漿，冰浴，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清作為肺臟總蛋白，-80 ℃保存。根據(jù)試劑盒說明提取細胞核和細胞質(zhì)蛋白，離心后的細胞核蛋白和細胞總蛋白進行SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入相應(yīng)抗體進行免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光，顯影，分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Prism 6.2軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘小鼠海藻糖處理后行為變化 C 組小鼠表現(xiàn)正常，正常飲食，體質(zhì)量緩慢增加。哮喘模型組小鼠呼吸加深加快，站立時搖晃，口唇發(fā)紺，煩躁，胸部呼吸起伏，腹部肌肉痙攣，頻繁點頭、抓耳和咳嗽。海藻糖處理組小鼠哮喘癥狀隨海藻糖劑量增加逐漸改善。

2.2 海藻糖顯著降低肺臟炎癥細胞浸潤 AS組小鼠巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)顯著高于C組小鼠。與AS組相比，海藻糖處理組小鼠巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)量均呈劑量依賴性降低（P＜0.05，圖1）。

圖1 肺臟炎癥細胞分類計數(shù)Fig.1 Lung inflammatory cells classification counts

2.3 海藻糖可改善肺臟炎癥因子分泌 AS組小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子IL-1、IL-4、IL-5、IL-13 及 IFN-γ 濃度顯著高于 C 組，與 AS 組相比，海藻糖處理組炎癥因子IL-1、IL-4、IL-5、IL-12 及IFN-γ濃度均呈劑量依賴性降低（P＜0.05，圖2）。

圖2 支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子濃度Fig.2 Concentrations of inflammatory factors in bronchoalveolar lavage fluid

2.4 海藻糖可改善哮喘小鼠IgE分泌 ELISA檢測結(jié)果顯示，AS 組小鼠支氣管肺泡灌洗液中IgE 含量顯著高于C組，與AS組相比，海藻糖處理組IgE含量呈劑量依賴性降低（P＜0.05），血清IgE 含量變化與肺泡灌洗液相同（圖3）。

圖3 支氣管肺泡灌洗液和血清中IgE含量Fig.3 IgE contents in bronchoalveolar lavage fluid and serum

2.5 海藻糖可促進小鼠肺臟CD4+淋巴細胞中轉(zhuǎn)錄因子EB 入核 提取小鼠肺臟CD4+淋巴細胞檢測TFEB 在細胞中的定位，結(jié)果顯示，CD4+淋巴細胞中，隨著海藻糖處理劑量增加，細胞中TFEB 表達升高，TFEB 下游分子PGC1α 水平也逐漸升高，表明海藻糖可能通過上調(diào)TFEB-PGC1α 軸改善哮喘炎癥。對于細胞核中的TFEB，研究發(fā)現(xiàn)AS 組小鼠TFEB基本存在于胞質(zhì)中，細胞核中幾乎無TFEB 存在，海藻糖處理后細胞核中TFEB 含量增加，細胞質(zhì)蛋白中TFEB 含量降低，入核增加（圖4），提示海藻糖可能通過促進TFEB入核改善哮喘小鼠肺臟炎癥。

圖4 細胞核中TFEB含量Fig.4 TFEB content in nucleus

2.6 TFEB 干擾后海藻糖介導(dǎo)的哮喘炎癥細胞浸潤改善作用消失 TFEB-shRNA AAV9 下敲效果如圖5 所示，TFEB-shRNA 顯著下調(diào)小鼠肺臟中TFEB表達，表明TFEB-shRNA AAV9 下調(diào)TFEB 表達有效。與Scramble 組相比，TFEB 干擾組炎癥細胞，包括巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)顯著增加，即TFEB 干擾后，海藻糖抑制哮喘巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞浸潤作用減弱（圖6），表明TFEB 是海藻糖改善哮喘炎癥細胞浸潤的重要調(diào)控因子。

圖5 TFEB-shRNA下敲效果Fig.5 TFEB-shRNA knockdown effect

圖6 TFEB干擾后肺臟炎癥細胞分類計數(shù)Fig.6 Lung inflammatory cells classification counts after TFEB interference

2.7 TFEB 干擾后海藻糖對哮喘炎癥因子和IgE 的改善作用消失 TFEB 干擾后，炎癥因子IL-1、IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ濃度及IgE 水平較Scramble 組明顯升高，即海藻糖抑制哮喘炎癥因子和IgE 水平的作用消失（圖7），表明TFEB 是海藻糖哮喘炎癥改善作用的重要介導(dǎo)因子。

圖7 TFEB 干擾后支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子和IgE濃度Fig.7 Inflammatory factors and IgE concentrations in bronchoalveolar lavage fluid after TFEB interference

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球范圍內(nèi)哮喘患者人數(shù)高達3.4億，且呈上升趨勢，主要與生活環(huán)境改變有關(guān)，尤其是空氣污染以及相關(guān)過敏原增加、室外PM2.5 顆粒增加普遍提高了氣道對外界刺激物的敏感度［14］。近年我國哮喘患病率逐年提高，最新全國流行病學(xué)調(diào)查顯示我國哮喘患病率為7.7%，尤其是兒童哮喘患病率高達9.5%［15］。目前治療哮喘的療效較好藥物是糖皮質(zhì)激素、支氣管擴張劑、茶堿和白三烯調(diào)節(jié)劑，其中吸入糖皮質(zhì)激素是哮喘長期治療的首選藥物，如布地奈德和丙酸氟替卡松等，但長期激素吸入會帶來諸多副作用，如咽部疼痛，咽部真菌感染，體質(zhì)量增加、血糖增高、骨質(zhì)疏松等，因此積極尋找治療哮喘的治療藥物具有重要臨床意義［16］。

研究發(fā)現(xiàn)海藻糖可通過促進巨噬細胞中TFEB入核上調(diào)自噬-溶酶體系統(tǒng)，改善動脈粥樣硬化［14，17］。巨噬細胞浸潤及炎癥因子分泌是誘發(fā)支氣管哮喘的重要因素，但海藻糖可否改善支氣管哮喘炎癥狀態(tài)？本研究通過給予支氣管哮喘小鼠海藻糖處理，檢測小鼠支氣管炎癥程度，判斷海藻糖對支氣管哮喘的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予海藻糖后，支氣管哮喘小鼠支氣管炎癥細胞浸潤減少，炎癥因子分泌減少，氣道炎癥狀態(tài)明顯改善，表明海藻糖對支氣管哮喘的緩解作用明顯。

海藻糖對蛋白聚集物的清除常伴隨細胞自噬［18］。自噬是一種進化上保守的細胞內(nèi)清除機制，可促進細胞內(nèi)錯誤折疊蛋白、脂質(zhì)聚集物和受損細胞器降解，促進細胞內(nèi)能量有效循環(huán)。激活自噬可限制巨噬細胞炎癥反應(yīng)，通過保存能量、清除錯誤折疊蛋白和/或受損細胞器以及改善線粒體功能改善氣道高反應(yīng)［19］。但海藻糖對支氣管哮喘小鼠氣道的自噬作用尚不清楚，因此課題組將進一步檢測海藻糖處理后哮喘小鼠支氣管中的自噬作用，明確海藻糖的作用機制。

全球兒童哮喘和肥胖發(fā)病率均呈上升趨勢［20］。流行病學(xué)研究將肥胖作為哮喘的危險因素，并提出了一種可能的因果關(guān)系［21］。肥胖型哮喘被認為是獨特的用于鑒定預(yù)后較差和較難控制型哮喘的重要表型，導(dǎo)致肥胖哮喘表型的各種機制已被提出，其中全身炎癥的機械效應(yīng)是普遍認可的機制，結(jié)合海藻糖改善脂質(zhì)代謝的作用可更好地理解為肥胖導(dǎo)致的氣道炎癥是哮喘風(fēng)險增加的原因之一［22］。海藻糖除一方面直接改善哮喘氣道炎癥外，還可能通過改善肥胖脂質(zhì)代謝和炎癥狀態(tài)進一步延緩哮喘進展，也為海藻糖對肥胖患者哮喘的改善作用提供了更為明確的理論依據(jù)［23］。此外，海藻糖對炎癥的改善作用可能與逆轉(zhuǎn)哮喘小鼠體內(nèi)Th1 和Th2 細胞免疫失衡有關(guān)，抑制Th2細胞免疫過激狀態(tài)，下調(diào)炎癥因子 IL-1、IL-4、IL-5、IL-13 及 IFN-γ 分泌，緩解氣道炎癥［16］。因此，海藻糖可能通過多種機制改善氣道炎癥，治療哮喘。

炎癥在多種疾病中（包括神經(jīng)退行性疾病、癌癥、衰老、代謝紊亂和其他感染性疾病）均發(fā)揮重要作用，因此，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程是一種頗具前景的治療包括神經(jīng)退行性變和癌癥的方法［24］。本研究表明海藻糖是一種重要的炎癥調(diào)節(jié)劑，可有效控制炎癥進而改善哮喘，在此基礎(chǔ)上課題組將進一步探究海藻糖可否作為創(chuàng)新藥物治療炎癥性疾病，尤其用于難治性慢行炎癥性疾病（如哮喘）治療。