金黃色葡萄球菌腸毒素B的中和性全人源抗體制備①

劉成華 劉 玉 馮健男 沈倍奮 楊 光 （軍事醫學研究院毒物藥物研究所，北京 100850）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，金葡菌）是造成人類食物中毒的常見致病菌之一，同時也是一種引起人和動物的局部化膿性感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎以及敗血癥、膿毒敗血癥等的重要致病菌［1］。腸毒素（Staphyloccucalenterotoxins，SEs）是由葡萄球菌分泌的細菌外毒素，目前已報道的有 SEA、SEB、SEC1-3、SED、SEE、SEF、SEG 等 20多種血清型，共稱為葡萄球SE 超抗原，是細菌性食物中毒、化膿性感染、院內感染的重要毒素［2-9］。其中SEB 因其超抗原特性以及在中毒性休克綜合征（SEB induced lethal shock，SEBILS）發病中的特殊意義而備受關注［10-11］。

SEB 是一種超抗原，極低劑量即可高效刺激哺乳動物及人的T 細胞增殖，并促使其釋放多種細胞因子和產生細胞毒作用［12-13］。人體感染SEB 后，可引起呼吸困難、胸痛、嚴重者可造成發熱、肺水腫、急性呼吸窘迫征、中毒性休克、多臟器的衰竭甚至死亡［14］。當前針對 SEB 誘導的 SEBILS 尚無非常有效的防治手段，靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIg）可緩解 SEB 誘導的炎性疾病的癥狀，但是IVIg 中特異性抗體含量低，副反應大并且有引起血源性病原體感染的危險［15］，多個研究小組已證實單克隆抗體對SEBILS 具有一定的中和保護作用［16-20］，但其保護功能并不理想，因此開發一種新型的高效的抗SEB抗體是目前SEB防治領域亟待解決的問題。

1 材料與方法

1.1 材料 金葡菌COL、大腸桿菌TG1、表達載體pET-28a（+）、pCDNA3.1、全人源 naive Fab 抗體庫、M13KO7 為本實驗室保存；細菌基因組DNA 提取試劑盒（賽百盛）；原核表達載體pMD-19T、限制性內切酶（NdeⅠ、XhoⅠ）（TaKaRa）；質粒提取、膠回收試劑 盒（Sango）；T4 DNA 連 接 酶 、DNA 聚 合 酶 、Trans2K plus DNA標志物、大腸桿菌感受態DH5α及BL21（DE3）（TransGen Biotech）；低相對分子質量蛋白標準（上海生化所）；Ni Sepharose 6 Fast Flow 純化柱 、CNBr-activated SepharoseTM4B 親 和 樹 脂（GE Healthcare）；Anti-His（Mouse）單克隆抗體、Goat Anti-Mouse IgG/HRP（中杉金橋）；anti-M13 抗體（義翹神州）；PEG8000（Sigma）；其他試劑為國產分析純；SPF級BALB/c純系雌性實驗小鼠（維通利華）。

1.2 方法

1.2.1 pET-28a-SEB 重組質粒的構建 以金葡菌COL基因組為模板，PCR 擴增seb，PCR 條件如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，60 s；35個循環；72 ℃，10 min。擴增片段大小為720 bp；利用限制性內切酶NdeⅠ和XhoⅠ將得到的seb基因片段雙酶切后連接至pET-28a 載體，轉化至E. coliBL21（DE3）感受態細胞中，經菌落PCR 及測序鑒定獲得陽性克隆。

1.2.2 重組SEB 的誘導表達及純化 挑取pET28a-SEB-BL21單克隆，接種至LB培養基（Kana+），37 ℃培養過夜；第 2 天轉接，OD600nm=0.6 時加入IPTG（0.05 mmol/L），繼續培養5 h，離心收集菌體；加入結合緩沖液（20 mmol/L Na3PO4，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH=7.4）重懸菌體，超聲破碎，收集上清進行Ni2+柱純化，收集洗脫液；洗脫液用PBS透析后進行SDS-PAGE檢測。

1.2.3 SEBILS 模型檢測重組 SEB 活性 8 周齡BALB/c 雌性小鼠24 只，隨機分成3 組；腹腔注射致敏劑 D-GlaN 20 mg/只；30 min 后，腹腔注射重組SEB，72 h 內觀察并記錄小鼠的存活情況。

1.2.4 抗SEB 單克隆抗體的生物淘選 包被重組SEB 蛋白（10 μg/ml，500 μl）4 ℃過夜后，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入噬菌體抗體庫（噬菌體投入量約為 1.2×1012PFU），室溫結合 1 h，PBS 洗滌 20 次后，加入 500 μl pH=2.2、0.1 mol/L 的 Gly-HCl 洗脫phage-Abs，收集洗脫液并用1.5 mol/L 的Tris-HCl（pH=8.8）中和至 pH=7.4；將 TG1 培養至 OD600nm=0.6 時，加入收集的洗脫液37 ℃感染30 min 后，4 000 r/min 離心15 min，菌體涂布于2YTAG平板上，37 ℃培養過夜；將過夜菌接種于2YTAG培養基中加入M13KO7輔助噬菌體進行噬菌體展示，采用PEG/NaCl沉淀，得到淘選后的噬菌體；3輪淘選后進行單克隆鑒定。

1.2.5 抗SEB 單克隆抗體陽性克隆的篩選 挑取淘選后的單克隆，接種于2YTAG 培養基中培養過夜，第2天轉接至新鮮培養基培養至OD600nm=0.6，加入5×109PFU M13KO7，37 ℃感染30 min后離心收集沉淀，1 ml 2YTAK 重懸，28 ℃、220 r/min培養過夜后進行phage-ELISA 鑒定陽性克隆，并將陽性克隆進行測序。

1.2.6 抗SEB 全人源單克隆抗體的制備 將載體pCDNA3.1 的NdeⅠ和SalⅠ識別序列間的小片段分別替換為抗SEB 單克隆抗體VL、VHDNA 小片段，分別得到輕、重鏈表達載體。將構建好的輕、重鏈表達載體質粒共轉染至293E細胞，進行全抗體分泌表達，經過Protein A 純化，超濾濃縮后獲得全抗體蛋白YG11-1、YG11-2。

1.2.7 SPR 測定YG11-1、YG11-2 的親和力 芯片CM5偶聯抗人Fc段抗體，將YG11-1、YG11-2分別稀釋至 0.5 μg/ml，保證約 100 RU 抗體被抗人 Fc 的抗體捕獲。將不同濃度SEB 重組蛋白流經固定相表面，分別測定YG11-1、YG11-2的親和力。

1.2.8 YG11-1、YG11-2 與天然 SEB 結合活性檢測 收集金葡菌COL培養上清，SDS-PAGE 電泳后電轉至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉后，分別與YG11-1、YG11-2（1 μg/ml）4 ℃結合過夜，TBST 洗滌 4 次后加入 Goat Anti-Mouse IgG/HRP 室溫孵育 30 min，TBST洗滌4 次后進行HRP-ECL 發光鑒定，利用X 膠片顯影定影。

1.2.9 小鼠致死性休克模型檢測YG11-1、YG11-2的中和活性 BALB/c 雌性小鼠40 只（鼠齡8 周）隨機分成5組；腹腔注射致敏劑D-GlaN，20 mg/只；30 min后腹腔注射蛋白及抗體混合物樣品，0.4 ml/只（其中重組SEB 20 μg），72 h內觀察各組小鼠的死亡情況。

1.3 統計學處理 采用Graph Pad Prism 5.0 軟件進行作圖，Log-rank（Mantel-Cox）Test 分析不同數據間統計學差異。

2 結果

2.1 SEB 蛋白的重組表達 以COL基因組為模板擴增獲得seb基因，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，約720 bp 處獲得目的條帶（圖1A），繼而將擴增產物酶切后克隆至pET-28a 載體。挑取pET-28a-SEB 陽性克隆，IPTG 誘導并超聲處理，利用Ni2+柱純化，最終獲得重組SEB蛋白（圖1B）。

圖1 SEB蛋白的重組表達Fig.1 Preparation of recombinant SEB protein

2.2 SEBILS 模型檢測重組SEB 活性 將小鼠隨機分組后，腹腔注射致敏劑D-GlaN 及重組SEB 蛋白，觀察各組小鼠72 h 內的死亡情況（圖2）。如圖所示，SEB的完全致死劑量為20 μg。

圖2 SEBILS模型檢測重組SEB活性Fig.2 Recombinant SEB activity was detected in mouse model of SEBILS

2.3 抗SEB 單克隆抗體的篩選 經過3 輪淘選后挑取所得的噬菌體單克隆進行ELISA 鑒定，并挑選陽性克隆送測序。結果顯示，陽性率為89.8%（圖3）。選取OD450nm值較高的10 個克隆送測序，獲得2 組抗體序列，且兩組抗體VH相同，分別命名為YG11-1、YG11-2。

圖3 抗SEB單克隆抗體陽性克隆鑒定Fig.3 Detection of positive clones of anti-SEB

2.4 YG11-1、YG11-2 的 制 備 PCR 分 別 擴 增YG11-1、YG11-2 的 VH、VL片 段 ，并 將 其 連 接 至pCDNA3.1，分別得到輕、重鏈表達載體，將其共轉染至293E 細胞后，進行全抗體分泌表達，經過Protein A純化，PBS超濾后獲得全抗體蛋白YG11-1、YG11-2（圖 4）。

圖4 YG11-1、YG11-2的制備Fig.4 Preparation of YG11-1 and YG11-2

2.5 YG11-1、YG11-2 的親和力測定 利用表面等離子共振技術分別檢測YG11-1、YG11-2 的親和力。測定不同濃度的2 株全人源單克隆抗體（YG11-1，YG11-2）與抗原之間相互作用響應值，利用軟件Biacore X100 Evaluation Software，version 2.0.1 對其相應曲線進行擬合，測得YG11-1、YG11-2 的親和常數如表1所示。

表1 SPR測定YG11-1、YG11-2的親和力Tab.1 SPR determinations of affinity of YG11-1 and YG11-2

2.6 YG11-1、YG11-2 與天然 SEB 蛋白結合活性檢測 利用YG11-1、YG11-2 抗體檢測金葡菌COL培養上清中天然的SEB 蛋白。結果顯示YG11-1、YG11-2 抗體能夠特異性識別COL培養上清中分泌的SEB蛋白（圖5）。

圖5 Western blot 檢測 YG11-1、YG11-2 與天然 SEB 蛋白結合Fig.5 Binding activity of YG11-1 and YG11-2 to natural SEB protein was detected by Western blot

2.7 YG11-1、YG11-2對SEBILS小鼠的保護作用將小鼠隨機分組后，對SEBILS模型小鼠分別腹腔注射不同劑量的YG11-1、YG11-2，觀察并記錄72 h 內各組小鼠的死亡情況。如圖6 所示，YG11-1 200 μg組小鼠存活率有所提高，而YG11-2 200 μg 組小鼠存活率高達100%，表明YG11-2 可有效提高SEBILS模型中小鼠存活率。

圖6 YG11-1、YG11-2對SEBILS小鼠的保護作用Fig.6 Protection of YG11-1 and YG11-2 in mouse model of SEBILS

3 討論

本研究成功構建了pET-28a-SEB 重組表達載體，表達并純化金葡菌重組蛋白SEB，并利用噬菌體抗體庫篩選出具有較高親和力的抗SEB 單克隆人源抗體YG11-1、YG11-2。進一步的研究結果表明，YG11-1、YG11-2 均能提高SEBILS 小鼠模型的存活率，并且YG11-2 能夠達到100%保護率。本研究獲得的兩株全人源抗體具有相同的VH，但其中和活性具有顯著差異，表明抗體的VL對其中和活性具有重要影響。

目前針對人體SEB 誘導的中毒性休克尚無有效的防治方法。靜脈輸注混合人體血清在一定程度上能緩解癥狀，但由于其來源的局限性和效果的不穩定性，它的應用受到很大限制［21-22］。已有研究表明單克隆抗體對SEBILS具有一定的保護作用，但也只能達到部分的保護效果，且Anti-SEB 多為鼠源單抗［12，23］。本研究利用噬菌體抗體庫技術成功篩選并制備了對SEB 具有較高親和力并且具有特異性中和作用的全人源單克隆抗體YG11-1、YG11-2，且YG11-2 可達到100%的保護效果，為SEB 的防治提供了新的選擇。