原發性肝癌患者外周效應功能T細胞的保護意義①

臧超然 覃 嶺 劉桂海 孫堅萍 李 康 張永宏

（首都醫科大學附屬北京佑安醫院生物醫學信息中心，北京 100069）

原發性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝臟最常見的惡性腫瘤，全球新診斷的HCC 病例和病死患者約有50%發生在我國［1］。目前HCC 的治療方案包括外科切除、肝臟移植、消融治療、經導管動脈栓塞、靶向治療、免疫治療等［2］。因為HCC發病隱匿，多數患者在確診時已進展至中晚期而失去根治機會［3］。免疫治療的興起給很多患者帶來希望。但由于目前關于腫瘤發生發展免疫機制的不明確以及免疫治療相關研究的欠缺等，免疫治療的療效仍不盡人意，其機制有待深入研究［4-5］。

腫瘤發生過程中，T細胞發揮主要清除作用。腫瘤細胞與T 細胞相互作用影響HCC 的發展方向［6］。在免疫系統的監視作用下，腫瘤細胞通過各種機制影響T 細胞的生存及命運從而獲得生存機會。因此，確定腫瘤特異性T 細胞并使該T 細胞發揮殺傷功能是控制腫瘤的關鍵所在。據此，課題組篩選并使用了5 種在HCC 中表達的腫瘤相關抗原（tumorassociated-antigen，TAA）——婆羅雙樹樣基因-4（SALL4）、黑色素瘤抗原A1（MAGE-A1）、MAGE-A3、紐約食管鱗狀上皮癌抗原1（NY-ESO-1）、滑膜肉瘤X 斷裂點2（SSX-2）組成抗原肽庫，檢測HCC 患者外周血中TAA 特異性T 細胞免疫反應，分析不同HCC患者間T 細胞的差異，并結合疾病預后分析T 細胞對疾病進展的影響。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 本研究納入原發性肝癌患者39例，男31例，女8例，平均年齡（55.26±1.31）歲，參照美國肝病研究協會（AASLD）的診斷標準診斷［2］，患者均未接受免疫相關治療。患者均采用介入治療并隨訪，每3~6 個月行CT 檢查，如發現肝臟或其他部位出現新發肝癌病灶，則診斷為治療后復發。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640 培養基購自美國Hyclone 公司；96 孔反應板購自美國 Millipore 公司；酶聯免疫斑點測定（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）試劑盒購自瑞典 Mabtech 公司；CD3 抗體（克隆：SK7）、PD1 抗體（克隆：EH12.2H7）購自美國Biolegend 公司；CD4 抗體（克隆：M-T477）、CD8 抗體（克隆：SK1）、CD45RA 抗體（克隆：HI100）、CCR7 抗體（克隆：150503）、CD27 抗體（克隆：M-T271）、CD152抗體（克隆：BNI3）購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 肽庫的合成 以蛋白文庫中SALL4、SSX2、MAGE-A1、MAGE-A3、NY-ESO-1 蛋白序列為模板，合成18 個氨基酸長、10 個氨基酸重疊的多肽片段259 條，并制成7 個反應肽庫，各肽庫所包含的肽段如表1所示。

表1 7個肽庫的肽段序列Tab.1 Peptide sequences of seven peptide pools

1.2.2 外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分離 以EDTA抗凝管留取肝癌患者外周血，采用密度梯度離心法分離得到PBMC［7］，取適量用于 ELISPOT 實驗，剩余細胞凍存于液氮中。

1.2.3 ELISPOT 上述采用密度梯度離心法分離得到的PBMC 經計數后，采用TAA 肽庫刺激，檢驗IFN-γ 分泌情況。試劑采用 IFN-γ 酶聯斑點免疫分析試劑盒，數據處理采用ELISPOT 酶聯斑點分析系統，陽性判斷標準為每孔斑點數-背景斑點數≥25個且＞2 倍的背景斑點數，結果采用單位斑點形成數/106單個核細胞（SFU/106PBMC）表示。

1.2.4 流式細胞術 將凍存的PBMC 復蘇，收集約1×106個細胞，以100 μl PBS 重懸。根據抗體說明書要求加入適量熒光標記抗體，4 ℃避光孵育20 min。PBS 洗滌 2 次，重懸于 500 μl 細胞固定液中用于流式細胞儀分析。

1.3 統計學處理 應用SPSS21.0 統計軟件，符合正態分布的數據以表示，兩組間計量資料比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布的數據以中位數［M（Q1，Q3）］表示，采用秩和檢驗。治療后生存分析采用Kaplan-Meier Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC 患者TAA 特異性T 細胞免疫反應 入組患者中有17例對任何TAA 均未出現特異性T 細胞免疫反應，陰性反應率為43.59%（17/39），22例患者的PBMC 至少能識別其中1 種TAA，陽性反應率為56.41%（22/39）。就目前所覆蓋的腫瘤相關抗原，僅有約半數患者的外周循環中存在特異性T細胞。

2.2 TAA 特異性T 細胞免疫反應不同患者間的預后分析 所有HCC 患者根據不同病情均接受介入治療，其中接受消融治療并達到完全消融目的的患者有27例。對達到完全消融目的的患者進行隨訪，隨訪時間為0~32 個月，隨訪CT 發現新發灶為隨訪終點。生存分析顯示，TAA 特異性T 細胞反應陽性患者的無復發生存期優于TAA特異性T細胞反應陰性患者，差異有統計學意義（P＜0.01，圖1）。

圖1 TAA 特異性T 細胞免疫反應陽性和陰性患者的生存分析Fig.1 Survival analysis of patients with positive and negative TAA-specific T cell immune response

2.3 不同TAA 特異性T 細胞免疫反應患者間T 細胞分化表型的差異 對外周血T 細胞的分化表型進行分析，結果顯示：TAA特異性T細胞免疫反應陽性患者外周血中CD4+和CD8+的TTE（terminal effector T cell，CD27-CD45RA+CCR7-）細胞百分比高于TAA 特異性T 細胞反應陰性患者［CD4：0.83%（0.34%，1.33%）vs0.36%（0.24%，0.58%），P=0.02；CD8：7.57%（3.46%，11.29%）vs4.76%（2.42%，6.77%），P=0.03］，且TAA 特異性T 細胞免疫反應陽性患者的CD4+TEM（effector memory T cell，CD27-CD45RA-CCR7-）顯著高于陰性患者［8.94%（6.30%，16.56%）vs6.32%（4.38%，11.77%），P=0.04］（圖2）。提示該部分患者中效應階段T細胞水平較高，有利于針對并及時消滅靶細胞。

圖2 TAA特異性T細胞免疫反應陽性和陰性患者的T細胞分化表型分析Fig.2 Differentiation phenotypic analysis of T cells in patients with and without TAA-specific T cell immune response

2.4 TAA 特異性T 細胞免疫反應陽性患者免疫檢查點水平的表達差異 在外周循環能夠檢測到TAA 特異性 T 細胞的 22例 HCC 患者中，疾病早期（BCLC-0/A）患者 14例，進展期（BCLC-B/C）患者8例。對這 22例患者 PBMC 的免疫檢查點 PD-1 和CD152 表達水平進行分析，結果顯示：早期患者的CD8+PD1+T 細胞百分比為（27.66±2.64）%，進展期患者的CD8+PD1+T 細胞百分比為（40.65±4.39）%，兩組間差異有統計學意義（t=2.71，P=0.01）；早期患者的 CD8+CD152+T 細胞百分比為（11.84±0.89）%，進展期患者的CD8+CD152+T細胞百分比為（17.96±1.72）%，兩組間差異有統計學意義（t=3.51，P＜0.01，圖3）。早期和進展期患者間CD4+T細胞比例未見明顯差異。提示進展期患者的耗竭性細胞毒性T細胞比例顯著增高。

圖3 TAA 特異性T 細胞免疫反應陽性的早期和進展期HCC患者耗竭性CD8+T細胞水平的比較Fig.3 Comparison of exhausted CD8+T cell levels in early and advanced HCC patients with positive TAA-specific T cell immune response

3 討論

近年來，腫瘤免疫學相關研究取得了重大進展，許多免疫治療方法已被應用于臨床，尤其是各種致力于改善和恢復 T 細胞功能的免疫療法［4-5，8-10］。腫瘤進展的相關免疫學機制也在被一步步深入探索并逐漸揭示。但我國HCC 人群T 細胞特點的數據較少，限制了基于我國人群的肝癌免疫治療發展［11-12］。

T 細胞是腫瘤發生發展過程中負責消滅惡性細胞的主要力量。T 細胞識別并消滅腫瘤細胞的過程稱為“腫瘤免疫循環”［13］，但由于腫瘤細胞的惡化過程可通過各種機制逃避“腫瘤免疫循環”的殺傷并獲得生存，使該循環過程在各個環節被改變，從而影響T細胞殺滅靶細胞功能。其中最直接的作用就是影響并改變T 細胞。從最初的初始T 細胞分化為最終的特異性效應性T 細胞的過程中，T 細胞的狀態和功能發生顯著轉變［14］。在這一過程中，腫瘤細胞與T 細胞間的復雜作用網絡導致T 細胞效應功能減弱甚至喪失，如免疫檢查點的表達、調節性T 細胞、腫瘤相關巨噬細胞、髓源抑制性細胞等負向免疫調節的細胞，抑制了T細胞效應功能的執行［15-20］。

本研究顯示，半數以上HCC 患者的外周循環中可檢測到TAA 特異性T 細胞免疫反應，表明特異性T 細胞的存在。這些T 細胞能夠監視并作用于循環中存在的腫瘤細胞，有利于及時消滅微小的循環轉移腫瘤細胞。同時，本研究結果也顯示TAA 特異性T 細胞免疫反應陽性患者的無復發生存期優于TAA特異性T 細胞免疫反應陰性患者，證明了TAA 特異性T 細胞能夠延緩腫瘤的出現，并發揮保護作用。因此誘導產生和維持特異性T 細胞對于控制腫瘤、改善患者預后意義重大。進一步分析患者外周T細胞分化表型，結果顯示，TAA特異性T細胞反應陽性患者外周循環中效應功能性CD4+/CD8+T 細胞水平顯著高于陰性患者，且CD4+T 細胞可能在T 細胞清除腫瘤的過程中發揮重要作用［21］。TAA 特異性T細胞反應陽性患者CD4+T 細胞中TEM 百分比顯著高于陰性患者，CD4+T 細胞對于細胞毒性T 細胞發揮殺傷功能的輔助必不可少，基于TEM 的增殖特性，有利于維持CD4+T 細胞的輔助作用。本研究還發現，雖然TAA 特異性T 細胞免疫反應陽性患者的效應性T細胞的水平相對較高，但伴隨腫瘤進展，免疫檢查點PD-1、CD152 的表達百分比也顯著增高，表明腫瘤的進展會限制T 細胞效應功能的發揮，使更多T細胞逐漸進入功能抑制狀態導致腫瘤細胞的逃逸和疾病的進展。

因此，腫瘤抗原特異性T 細胞是控制腫瘤的關鍵。腫瘤細胞在與免疫細胞的博弈過程中進化出各種機制誘導T 細胞向失能狀態轉變：識別腫瘤細胞的功能性T細胞的減少、誘導免疫檢查點表達等。本研究結果提示：誘導產生效應性的特異性T細胞、阻斷免疫檢查點的表達是控制HCC 的重要途徑。因此，腫瘤疫苗的研究和應用、嵌合抗原受體T細胞免疫療法、免疫檢查點抑制劑等方法的合理整合，在產生精準靶向腫瘤的T細胞的同時避免了免疫檢查點的表達，使靶向性T 細胞維持功能，可能會為HCC的免疫治療帶來更好的療效。