血清IL-17A通過抑制DEL-1參與慢性乙型肝炎發病的機制研究

陳 誠 楊青青 陳邦濤 陳偉慶

（重慶大學附屬腫瘤醫院消化內科，教育部生物流變科學與技術重點實驗室，重慶 400044）

全球約有2.4 億人因感染乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）成為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者，而未經抗病毒治療進展至肝硬化者占比達15%~40%，極大增加了肝癌與肝衰竭的發生率［1］；此外，因HBV 特殊的復制中間體共價閉合環狀DNA（cccDNA）難以從肝細胞中被清除，CHB 目前僅能以血清乙肝表面抗原（HBsAg）持續陰轉（即功能性治愈）為理想治療終點，但即使經過1~5年的一線抗病毒治療，仍僅有5%~13%的CHB 患者可獲得 HBsAg 陰轉［2-3］。故 HBV 慢性感染仍嚴重威脅著全球公共衛生。疫苗和阻斷藥在預防HBV 新發感染中已取得顯著成績，故抗HBV 治療才是對WHO提出的2030年全面消滅CHB這一目標的最大挑戰。為通過多元治療以使更多CHB 患者達到功能性治愈，其關鍵是深層次理解HBV與宿主的互作關系。

有研究表明，T 細胞介導的適應性免疫應答通過分泌大量促炎或抑炎因子在HBV 逃逸宿主免疫監視中發揮重要作用［4-6］。其中，分泌重要促炎因子IL-17A 的 Th17 和 Tc17 細胞在 CHB 血循環和肝組織中均顯著升高，且與肝組織損傷程度呈正相關［7-9］，但HBV 感染誘生的IL-17A 通過何種機制在復雜的微環境中促進HBV 引起肝損傷仍不明確。闡明CHB 患者IL-17A 上調的原因可為通過靶向抑制IL-17A 產生，減輕HBV 相關肝損傷提供證據支撐。IL-17A 表達與分泌受多因素調控，近年的部分研究提示，內皮細胞發育調節基因-1（developmental endothelial locus-1，DEL-1）可通過調節 IL-17A 穩態參與多種器官特異或系統性炎癥性疾病［10］。分子量約52 kD 的DEL-1 又稱為表皮生長因子樣重復序列和盤狀蛋白I 樣結構域-3（EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3，EDIL3），在肺、腦及骨組織等組成性地表達［10］，但其在肝臟中的表達及功能發揮尚不明確，尤其是無從考證DEL-1是否會通過與IL-17A的相互作用參與CHB 發病。本研究擬基于臨床相關性分析和體外細胞實驗初步探究IL-17A/DEL-1 通路在CHB 中的作用，以期能進一步加深對HBV致病機制的理解。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取2015 年至2016 年長治醫學院附屬和平醫院CHB初治患者80例，同時從該院體檢部選取年齡、性別及身體質量指數（BMI）與CHB 患者相匹配的健康志愿者40例為對照。CHB的診斷參照中國《慢性乙型肝炎防治指南》（2015 年版），同時排除：①正在或既往接受核苷酸類似物和/或干擾素治療；②合并其他病毒性肝炎或人類免疫缺陷病毒感染或細菌感染性疾病；③合并酒精性或非酒精性脂肪肝病、藥物性肝病或自身免疫性肝病等；④合并失代償期肝硬化、肝癌或其他系統性疾病等；⑤近半年內系統地使用過糖皮質激素等免疫抑制劑或抗生素。所有入組對象在抽血前均簽署書面知情同意書，本研究經過長治醫學院附屬和平醫院倫理委員會審核批準。

1.1.2 主要試劑與細胞來源 人IL-17A ELISA kit（Elabscience，#E-EL-H5812c）；人 DEL-1 ELISA kit（R&D SYSTEMS，DY6046-05）；逆 轉 錄 試 劑 盒Quantscript RT Kit（天根生化，#KR103）；熒光定量試劑盒FastFire qPCR PreMix（天根生化，#FP207）；重組人IL-17A（Abcam，#ab9567）；重組人DEL-1（R&D SYSTEMS，#6046-ED）；DEL-1（ABclonal，#A15772）；IL-17A（ABclonal，#A0688）；β-actin（EASYBIO，#BE0037）；人外周血淋巴細胞分離液（索萊寶，#P8610）；人正常肝細胞（LO2）和人髓系白血病單核細胞（THP-1）均購自中科院細胞庫；HepG2.2.15（穩定表達并分泌HBV 病毒顆粒）和HepG2 為本實驗室保存；細胞培養用新生胎牛血清（FBS）及DMED培養基均購自Gibco。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集所有入組受者的年齡、性別、身高、體質量、肝功能指標、HBV 病毒學指標、HBV 感染病史、合并疾病、用藥史等人口學及臨床資料。

1.2.2 外周血標本處理 用抗凝管抽取患者空腹靜脈血15 ml，其中3 ml 用于離心取血清，并凍存于-80 ℃待測血清中的DEL-1 及IL-17A 蛋白（根據各ELISA 試劑盒說明書操作，每份樣品進行獨立3 次檢測后取均值）；采用Ficoll-Paque 梯度離心法從余下的12 ml全血中分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），其中1/3 PBMC立即加入1 ml Trizol溶解，2/3 PBMC加入1 ml含20%DMSO的細胞凍存液，均凍存于液氮中。PBMC 的提取在細胞超凈臺中操作，嚴格無菌。

1.2.3 細胞培養及刺激 HepG2.2.15、HepG2、THP-1、PBMC（源于對照組人群）及LO2 細胞均采用含10%FBS 及1%青鏈霉素的DMEM 培養于37 ℃、含 5%CO2的孵箱中。其中，THP-1、PBMC 及 LO2 細胞待培養至約80%融合度時，于培養基中加入等量HBV 病毒上清液（VS）聯合重組人IL-17A 或重組人DEL-1處理24 h，重組蛋白劑量參考其他文獻［11］。

1.2.4 熒光定量PCR（qPCR） 采用Trizol 法從全血分離的PBMC 或經培養處理的PBMC 中提取細胞總 RNA，取其中 1 μg 總 RNA 經 Quantscript RT Kit逆轉為cDNA（總體積20 μl），稀釋5倍后取2 μl cDNA經 FastFire qPCR PreMix 在 ABI 7500PCR 儀中熒光定量檢測DEL-1、IL-17A和β-actin的mRNA水平，所用引物列于表1，程序為預變性95 ℃1 min 和40 個PCR 循環（95 ℃ 5 s+55 ℃ 10 s+72 ℃ 15 s），采用2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達量。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

1.2.5 蛋白免疫印跡（Western blot） 采用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液從THP-1 和LO2 細胞中提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取30 μg 蛋白加入上樣緩沖液，于10%SDS-PAGE 凝膠中進行恒壓（80 V/120 V）電泳，而后于恒流（400 mA）條件下將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃過夜孵育，二抗室溫孵育2 h，采用ECL 化學發光法檢測靶蛋白。

1.3 統計學分析 所有原始數據編入Excel 表格，采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計學分析。連續性或二分類變量分別采用或率（%）表示，組間比較采用Studentt或卡方檢驗，相關性分析采用Pearson 線性相關分析，P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象臨床資料比較 如表2所示，與對照組相比，CHB 組在性別、年齡及BMI 等方面差異均無統計學意義（P＞0.05）；但 CHB 組肝炎（ALT、AST）、肝功能（TBiL 及白蛋白）及病毒學指標（HBVDNA、HBsAg 及HBeAg）與對照組相比差異有統計學意義。

表2 納入研究對象基本資料Tab.2 Characteristics of subjects at baseline

2.2 血清DEL-1 與IL-17A 在CHB 患者中的相關性 如圖 1A、B 所示，CHB 組血清 DEL-1 蛋白水平顯 著 低 于 對 照 組［（33.82±12.80）vs（95.38±31.42）ng/ml，P＜0.001］，而 CHB 組血清 IL-17A 蛋白水平顯著高于對照組［（71.21±21.23）vs（24.75±10.36）pg/ml，P＜0.001］；進一步相關性分析發現，CHB組血清DEL-1水平分別與血清IL-17A（r=-0.341，P=0.002，圖 1C）和血清 ALT（r=-0.398，P＜0.001，圖1D）呈顯著負相關，與AST、TBiL、白蛋白、HBVDNA、HBsAg均無相關性（P＞0.05）。

圖1 血清DEL-1與IL-17A蛋白含量分析Fig.1 Analysis of serum DEL-1 and IL-17A protein

2.3 DEL-1、IL-17A mRNA 在 PBMC 中 的 表達情況 qPCR 結果顯示，CHB 組 IL-17A mRNA 相對表達水平是對照組的2.62±0.57 倍（P＜0.001，圖2A），但DEL-1 mRNA 在2 組間差異無統計學意義；健康人PBMC經HBV上清液體外刺激后，PBMC中DEL-1 mRNA 仍無明顯變化，而IL-17A mRNA 顯著上升（P=0.016，圖 2B）；外源性給予 DEL-1 處理后，IL-17A mRNA上升幅度隨DEL-1濃度增加呈劑量依賴性減少（圖2C）；為取得蛋白水平研究證據，進一步體外培養THP-1細胞（圖2D），結果表明，經DEL-1處理或靜息狀態的THP-1 細胞均不表達IL-17A 蛋白，但VS 可刺激IL-17A 蛋白高表達，該上調作用可被外源活性DEL-1蛋白部分抑制，但各處理組THP-1細胞中DEL-1蛋白豐度均較低且無明顯變化。這一結果提示CHB 患者血清IL-17A 升高至少部分源于HBV病毒成分對PBMC的刺激作用，且受血清DEL-1蛋白的調控。

圖2 DEL-1和IL-17A在單核細胞中的表達分析Fig.2 Analysis of DEL-1 and IL-17A expressions in mononuclear cells

2.4 DEL-1 蛋白在肝細胞的表達情況 進一步體外培養LO2 細胞以探究CHB 患者血清DEL-1 下調與IL-17A 的關系（圖3），結果表明，靜息狀態下LO2細胞具有較高豐度的DEL-1 蛋白表達水平，VS 刺激對DEL-1蛋白水平無明顯影響；但無論是否有VS刺激，外源活性IL-17A 均可顯著下調LO2 細胞中的DEL-1 蛋白水平；上述各處理組均未檢測到IL-17A表達。提示CHB 患者血清DEL-1 下調可能與HBV病毒成分刺激PBMC分泌IL-17A有關。

圖3 DEL-1和IL-17A在人正常肝細胞中表達分析Fig.3 Analysis of DEL-1 and IL-17A expressions in human normal liver cells

3 討論

病毒與宿主相互作用的研究（尤其是對宿主抗病毒免疫應答規律的探索）是揭示病毒致病機制及開發抗病毒藥物的永恒主題。無論是在發現HBV感染特異性受體（?；悄懰峁厕D運多肽）的前后，宿主是否對HBV 感染具備固有免疫應答仍備受爭議，其很大原因在于HBV 感染模型的異型性；而源于臨床的大量證據一致證實，以淋巴細胞異?；罨尫叛装Y介質為中心的適應性免疫應答是調控HBV 感染與致病的關鍵因素［6，12］。病毒復制和肝損傷是HBV 感染后的兩個經典生物學事件，HBV 病毒成分誘發肝組織損傷與外周血或肝組織局部Th17 異常增多及活化密切相關［9，13］。LI 等［14］研究發現血清IL-17A水平在HBV 急性感染、CHB及免疫耐受期患者中均有顯著差異，與此類似，本研究亦證實CHB患者較正常人具有更高的血清IL-17A 表達。另有研究進一步提示，HBV 可通過誘導趨化因子CCL17和 CCL22 表達來促進分泌 IL-17 的 T 細胞（Th17 和Tc17）進入肝組織加重肝損傷，而IL-17 還可經由IL-6/STAT3 通路促進HBV 所致的肝硬化進展為肝癌［8，15］。此外，臨床上用于實現 CHB 功能性治愈的核苷酸類似物初始或序貫聯合聚乙二醇干擾素也被證實能夠抑制CHB 患者外周血PBMC 分泌IL-17蛋白［16-17］。這些證據不禁再度令人思考IL-17 在HBV感染致病中的貢獻量和可能機制。

IL-17A 是IL-17 家族中最重要的一員，主要在CD4+Th17 細胞中表達，受上游IL-23 蛋白（由巨噬細胞及樹突狀細胞分泌）活性調控。但近年的研究發現，血清DEL-1 蛋白與多種IL-17A 升高的疾病（如牙周炎、敗血癥、過敏性哮喘及炎癥性骨質疏松癥等）均有關［10，18］。本研究發現 CHB 患者血清 DEL-1蛋白水平顯著降低，且其表達水平與IL-17A 和ALT均呈負相關，此證據進一步支持DEL-1 與IL-17A 之間的聯系。血清蛋白DEL-1主要由血管內皮細胞表達及分泌，其結構由N 端3 個表皮生長因子樣結構域（E1-E3）和C 端2 個盤狀結構域（C1-C2）構成；其中，E2 中 RGD 基序與炎癥細胞表面 CD11a/CD18 結合介導其黏附并浸入血管內皮或其他組織細胞，從而誘發炎癥［19］。但越來越多研究表明，其他多種細胞（如巨噬細胞及腫瘤細胞等）均可高表達DEL-1蛋白，且其在炎癥發生至緩解的整個過程及惡性腫瘤進展中均有重要作用［20-23］。

本研究探索PBMC 是否為血清DEL-1 的重要來源，結果發現，DEL-1 mRNA 表達量在CHB 組與健康人組差異無統計學意義，體外采用VS 刺激正常PBMC 或THP-1 細胞亦不能顯著改變其mRNA 或蛋白表達，且胞內蛋白豐度較低，這在一定程度上說明血清DEL-1 蛋白并非來自PBMC；相反，課題組卻在LO2 細胞中檢測到較高豐度的DEL-1 蛋白，但并不受VS影響，提示健康人群中高血清DEL-1水平可能部分來源于正常肝細胞，而HBV 能特異性感染肝細胞引起組織損傷釋放ALT，進而可能破壞肝細胞穩態導致CHB 患者血清DEL-1 減少，這或許能解釋血清中DEL-1與ALT呈負相關這一現象。但IL-17A是如何與抑炎蛋白DEL-1 相互關聯從而調控CHB肝臟炎癥反應的呢？本研究發現，重組DEL-1 蛋白可劑量依賴性地抑制PBMC 和THP-1 細胞中IL-17A mRNA 或蛋白表達，而重組IL-17A 蛋白亦可抑制LO2細胞中DEL-1蛋白含量，這與臨床標本中DEL-1與IL-17A呈負相關的結論一致。DEL-1抑制IL-17A的具體機制目前仍不清楚，但比較明確的是，IL-17A可通過激活糖原合酶激酶3β（GSK3β）進而抑制DEL-1 上游轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白β（C/EBPβ）的轉錄活性來下調 DEL-1 的蛋白表達［10，24］。綜上，推測DEL-1 是肝細胞維持穩態的一種抑炎因子，但在 CHB 患者中，HBV 可刺激 PBMC 分泌大量的IL-17A，進而下調肝細胞DEL-1蛋白水平，從而產生肝炎癥狀。

本研究存在如下不足：首先，DEL-1與IL-17A的關系是否在HBV 感染后的不同臨床病程（如急性肝炎、免疫耐受期、有效抗病毒治療前后）中均存在尚不明確；其次，CHB 患者血清DEL-1 的改變是源于肝細胞損傷的證據并不充分，尚不能排除源于血管內皮細胞功能改變的可能；第三，未評估血清IL-17A和DEL-1蛋白對HBV復制的影響，也未探究HBV各病毒成分對此2種血清蛋白的直接作用。欲進一步解決以上問題，可納入多類型HBV 感染的臨床病例，開展HBV 感染原代肝細胞和實驗動物等相關研究。

總之，本研究證實了血清IL-17A 與DEL-1 在CHB 患者中的關系，并初步表明血清IL-17A 可通過抑制肝細胞DEL-1 表達促進HBV 感染引發肝臟炎癥，這進一步豐富了對T 淋巴細胞介導的適應性免疫應答在HBV 慢性感染引發肝組織損傷作用的理解。