超聲輔助法提取黑穗醋栗中黃酮的研究

李大龍，徐倩倩，李興國

(1.東北農業大學 農業農村部東北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，哈爾濱 150030；2.東北農業大學 園藝園林學院，哈爾濱 150030；3.東北農業大學 生命科學學院，哈爾濱 150030)

黑穗醋栗(RibesnigrumL.)是一種小型多年生灌木，原產于中歐和北歐[1]，在我國產地主要集中在新疆和黑龍江兩地區[2]，黑穗醋栗富含楊梅素、槲皮素和山奈酚等黃酮類次生代謝產物，是一類眾所周知的對人體健康有益的非營養植物化學物質[3]。黃酮具有抗氧化活性和抗菌活性[4-5]，在抗腫瘤和抗癌方面具有一定的功效且毒副作用較小[6]，在體內是餐后葡萄糖反應的調節劑[7]，同時具有抗糖尿病和抗動脈粥樣硬化的功能[8-9]。

近年來，已有多篇研究報道了從不同植物中提取黃酮的方法，包括有機溶劑提取法[10]、微波輔助提取法[11]、超聲波輔助提取法[12-13]、酶法提取[14]等。在提取黑穗醋栗中黃酮的過程中，提取溫度超過50 ℃極易破壞黃酮的結構和活性[15]。超聲波輔助法主要是利用超聲波產生的空化作用，破壞植物細胞壁并使其細胞內物質溶出，具有提取溫度低、操作簡便、收率高、無污染等優點[16]。目前雖有利用超聲波輔助法提取黑穗醋栗葉片中黃酮的報道，但利用超聲波輔助提取黑穗醋栗中黃酮的方法還未見報道，本試驗利用超聲波輔助法低溫提取黑穗醋栗中黃酮，保證了提取物結構和功能的穩定性，為黑穗醋栗黃酮的提取產業化提供了理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

黑穗醋栗：東北農業大學園藝實驗站，洗凈瀝干后冷凍于冰箱待用。

1.2 試劑

蘆丁：中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、亞硝酸鈉、三氯化鋁、氫氧化鈉、硝酸鋁等：均為分析純，天津市東麗區天大化學試劑廠。

1.3 主要儀器設備

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；CX-500型超聲波清洗機 北京醫療設備二廠；R-205型旋轉蒸發器 上海申勝生物技術有限公司；JY92-2D 型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機 常州國華電器有限公司；電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 黑穗醋栗中黃酮含量的測定

本試驗以蘆丁為標準品，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測定總黃酮的含量[17]，蘆丁濃度c與吸光度A的標準曲線線性回歸方程式為：A=13.986c+0.0032，相關系數R2=0.9996。黃酮總質量計算方法見公式(1)和公式(2)：

M1=P·c·V。

(1)

M2=M1/m。

(2)

式中：M1為黃酮質量(mg)，V為定容體積(mL)，c為黃酮提取液濃度(mg/mL)，P為提取液稀釋倍數，M2為黃酮提取量(mg/g)，m為黑穗醋栗質量(g)。

1.4.2 超聲波輔助法最佳提取工藝的確定

用組織搗碎勻漿機將黑穗醋栗打碎為勻漿并準確稱取5.0000 g，按設定的液料比加入95%乙醇，將超聲波輔助提取后所得的粗提液進行過濾，濾液通過旋轉蒸發器除去溶劑，所得固形物用超純水溶解后用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層減壓旋轉蒸發進行濃縮，濃縮后的粗產物用95%乙醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，用1.4.1中方法測定黃酮含量，確定最佳提取工藝。

1.4.3 單因素試驗

分別選擇提取液料比、提取時間和超聲波功率3個因素的不同條件進行試驗，考察其對黃酮提取量的影響，每項試驗重復3次，具體方案見表1。

表1 超聲波輔助提取法單因素試驗表

1.4.4 正交試驗

在上述單因素試驗的基礎上，以黃酮提取量為考察指標，采用三因素三水平正交試驗表L9(33)設計試驗，具體方案見表2。

表2 超聲波輔助提取法正交試驗因素水平表

1.4.5 黑穗醋栗黃酮對油脂抗氧化性的研究

配制0.01 mol/L的Na2S2O3溶液：準確稱取1.2429 g Na2S2O3·5H2O，溶解后定容于500 mL容量瓶中待用。分別稱取20 g豆油置于2個具塞三角瓶內，向其中一瓶中加入5 mL黃酮提取液，另一瓶中加入5 mL 95%乙醇進行對照。分別從2個三角瓶中稱取1 g油樣置于碘量瓶中，加入25 mL氯仿∶冰乙酸(2∶3)混合溶液，再加入1 mL飽和KI溶液，加塞密閉搖勻，避光靜置30 min。向碘量瓶中加入50 mL蒸餾水，以淀粉作為指示劑，用0.01 mol/L的Na2S2O3溶液滴定至終點，記錄消耗Na2S2O3標準溶液的體積。POV值計算方式見公式(3)：

(3)

式中：POV為過氧化值(meq/kg)，c為Na2S2O3標準溶液的濃度(mol/L)，V為消耗Na2S2O3標準溶液的體積(mL)，m為取樣質量(g)。

將三角瓶中的剩余試樣置于(60±0.5)℃的恒溫箱中，隔1 d測定和記錄一次過氧化值。

2 結果與分析

2.1 黑穗醋栗中黃酮含量的測定

2.1.1 吸收波長的確定

蘆丁標準溶液顯色后在400～600 nm波長范圍內的吸收光譜見圖1。

圖1 紫外吸收光譜圖

由圖1可知，顯色絡合物在503 nm處有最大吸收波長，因此選擇503 nm為本試驗的測定波長。

2.1.2 標準曲線的繪制

用移液管吸取蘆丁標準溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL置于試管中，顯色后在503 nm處測定吸光度值，結果見表3。

表3 蘆丁標準曲線的結果

以濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，見圖2。蘆丁濃度c與吸光度A的標準曲線線性回歸方程式為：A=13.986c+0.0032，相關系數R2=0.9996。

圖2 蘆丁標準曲線

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 提取液料比的確定

在超聲波功率300 W、超聲時間30 min的條件下，考察不同液料比(4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1，mL/g)對黃酮提取量的影響，結果見圖3。

圖3 提取液料比對提取量的影響

由圖3可知，液料比在4∶1～12∶1的范圍內，黃酮的提取量與液料比呈正相關，當液料比超過8∶1時，提取量的增加變緩，12∶1時達到最大值，超過12∶1時開始下降。隨著提取溶劑的增加，溶出的物質包括黃酮化合物和雜質均在增加，影響了黃酮化合物的提取量。根據單因素試驗結果，選擇液料比10∶1、12∶1、14∶1(mL/g)進行正交試驗。

2.2.2 超聲波提取時間的確定

在超聲波功率300 W、提取液料比10∶1(mL/g)的條件下，考察不同提取時間(10，20，30，40，50，60 min)對黃酮提取量的影響，結果見圖4。

圖4 提取時間對提取量的影響

由圖4可知，超聲波時間在10～40 min范圍內，黃酮的提取量與提取時間呈正相關，40 min時達到最大，超過40 min開始下降。隨著提取時間的增加，溶出的黃酮化合物與空氣接觸時間也在增加，加速了其被氧化的過程，因此黃酮化合物的提取量下降。根據單因素試驗結果，選擇提取時間30，40，50 min進行正交試驗。

2.2.3 超聲波功率的確定

在液料比10∶1(mL/g)、超聲時間30 min條件下，考察不同超聲波功率(200，300，400，500，600，700，800 W)對提取量的影響，結果見圖5。

圖5 超聲波功率對提取量的影響

由圖5可知，超聲波功率在200～400 W范圍內，黃酮的提取量與超聲波功率呈正相關，400 W時達到最大，超過400 W提取量緩慢下降。超聲波功率過高會破壞黃酮化合物的活性結構，因此應在適宜的超聲波功率下進行黃酮的提取。根據單因素試驗結果，選擇超聲波功率300，400，500 W進行正交試驗。

2.3 正交試驗結果分析

通過單因素試驗，選擇提取液料比(10∶1、12∶1、14∶1，mL/g)、超聲波提取時間(30，40，50 min)、超聲波功率(300，400，500 W)進行三因素三水平正交試驗，結果見表4。

表4 超聲波輔助提取法正交試驗結果

利用SAS軟件對試驗結果進行分析，確定本試驗的最佳工藝條件，分析結果見表5和表6。

表5 超聲波輔助提取法的極差分析表

表6 超聲波輔助提取法的方差分析表

由表5可知，本試驗討論的3個因素對提取量影響的顯著順序為C>A>B，即超聲波功率對試驗結果的影響最顯著，液料比的影響次之，超聲時間的影響最小。確定超聲波輔助法的最佳提取工藝為A3B1C2，即提取液料比12∶1(mL/g)，超聲時間30 min，超聲波功率400 W，此條件下提取量為0.728 mg/g。

由表6可知，本試驗模型中F=277.16，概率P=0.0036，小于臨界值α(0.05)且小于0.01，具有極顯著性。在本試驗討論的3個因素中，A(提取液料比)的概率P=0.0099，對試驗的影響具有極顯著性；B(提取時間)的概率P=0.0349，具有顯著性；C(超聲波功率)的概率P=0.0014，具有極顯著性。

2.4 黑穗醋栗黃酮對油脂抗氧化作用的試驗結果

黑穗醋栗黃酮對油脂抗氧化作用的試驗結果見圖6。

圖6 黃酮對油脂過氧化值的影響

由圖6可知，豆油在正常條件下會被氧化，過氧化值升高。加入黑穗醋栗黃酮后，過氧化值緩慢升高，表明黑穗醋栗中黃酮對豆油的氧化有抑制作用。

3 結論

本研究以黑穗醋栗為原料，采用超聲波輔助法進行提取試驗，通過單因素試驗及三因素三水平L9(33)正交試驗確定最佳提取工藝。結果表明，在單因素試驗中液料比、提取時間和超聲波功率隨著因素水平的增加均表現為先上升后下降的趨勢。在正交試驗中，由極差分析可知，3個因素對黃酮提取的影響大小為超聲波功率>液料比>超聲時間。超聲波輔助提取法提取黑穗醋栗中黃酮的最佳提取條件為：提取液料比12∶1(mL/g)，提取時間30 min，超聲波功率400 W，此條件下黃酮的提取量為0.728 mg/g。對黃酮抗氧化能力進行測定，結果表明，黃酮對豆油的氧化有抑制作用，具有抗氧化活性，故可在食品中添加黑穗醋栗黃酮起到抗氧化作用，從而延長食品的貯存時間。