穩(wěn)定ANAMMOX工藝污泥顆粒化及微生物多樣性分析

劉人源, 涂 智, 陳 晨, 彭 陽, 章乘峰, 陳 宏,

（1.廣東自遠環(huán)保股份有限公司，廣東 梅州 514700；2.長沙理工大學水利與環(huán)境工程學院，洞庭湖水環(huán)境治理與水生態(tài)修復湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410114；3.長沙民政職業(yè)技術(shù)學院，湖南 長沙 410004；4.江西環(huán)境工程職業(yè)學院，江西 贛州 341002）

0 引言

厭氧氨氧化是在厭氧或缺氧條件下， 微生物以NO3-或NO2-為電子受體， 以NH4+為電子供體， 將2種氮素轉(zhuǎn)化為N2的生物反應過程[1-3]。相比傳統(tǒng)生物脫氮，其無需外加碳源、節(jié)省曝氣和堿度消耗、剩余污泥產(chǎn)量和溫室氣體排放量小[4-7]。然而，ANAMMOX細菌對環(huán)境條件變化極為敏感，生長速度慢[8]，不利于其工程化應用[9]。 顆粒污泥不僅沉降性能好，可抗沖擊負荷，還可有效持留生物量，從而保證其良好的脫氮性能。 因此，ANAMMOX 污泥的顆粒化及其自養(yǎng)脫氮性能的提升逐漸成為研究和應用的熱點[10-12]。 國內(nèi)外研究者已經(jīng)進行了大量研究[13-15]， 但缺乏穩(wěn)定ANAMMOX 工藝污泥顆粒化過程中自養(yǎng)脫氮性能變化規(guī)律及其功能微生物演替的數(shù)據(jù)。

通過調(diào)控進水氮濃度和水力停留時間， 對穩(wěn)定ANAMMOX 工藝運行下反應器脫氮性能、 污泥粒徑、微生物多樣性及豐度變化情況進行研究，從而為工程中ANAMMOX 顆粒污泥的培養(yǎng)及強化提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置及運行

實驗裝置示意見圖1。 由圖1 可以看出，反應器由有機玻璃制成， 主反應區(qū)內(nèi)徑為10 cm， 高為80 cm，三相分離器內(nèi)徑為13.93 cm，高為30 cm，總?cè)莘e為10.25 L，有效容積為6.25 L。 反應器外包裹鋁箔海綿材料以避光；設(shè)有循環(huán)水浴恒溫槽，保持反應器內(nèi)主體溫度為35±1 ℃。 原水和回流混合液一同進入主反應區(qū)，通過三相分離器實現(xiàn)泥水分離，出水流入沉淀池。初始水力停留時間（HRT）設(shè)定為12 h。

圖1 厭氧氨氧化顆粒污泥UASB 反應器示意

1.2 實驗用水及接種污泥

實驗進水為模擬廢水，以NH4+-N 和NO2--N 為氮源，分別由NH4HCO3和NaNO2按需提供，NH4+-N和NO2--N 的質(zhì)量濃度比值控制在1.00 ～1.32 之間，起始TN 質(zhì)量濃度為100 mg/L；由NaHCO3提供無機碳源， 同時調(diào)節(jié)進水pH 值在7.8 ～8.5 之間，NaHCO3質(zhì)量濃度為400 mg/L。 其他組分為：CaCl2，KH2PO4，MgSO4·7H2O，EDTA-2Na，F(xiàn)eSO4·7H2O 質(zhì)量濃度分別為25，50，50，3，6.67 mg/L， 微量元素濃縮液的體積分數(shù)為0.125 mL/L， 其成分為：NaWO4·2H2O 和NaMo4·2H2O 質(zhì)量濃度分別為0.63 和0.275 mg/L。 所用藥品均為分析純。

接種污泥取自實驗室上流式厭氧污泥床反應器UASB-4L 中，該厭氧氨氧化污泥總體積約為1.5 L，顏色為棕黃色，約占反應器有效容積的24%，反應器運行各階段操作條件見表1。

表1 反應器運行各階段設(shè)計工況條件

1.3 測試項目與方法

每日采集水樣、監(jiān)測反應器水溫、進出水pH 值和產(chǎn)氣量變化， 所有水樣測定前均先經(jīng)過0.45 μm濾紙過濾。其中，pH 值采用玻璃電極法（PHSJ-3F 型pH 計，上海精密儀器儀表有限公司）測定；溫度采用電子水溫計測定； 產(chǎn)氣量采用濕式氣體流量計（LMF-1， 北京金志業(yè)儀器設(shè)備有限公司） 測定；NH4+-N，NO2--N 和NO3--N 濃度參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》第4 版所推薦的標準分析方法測定。

反應器啟動后于第1 天、第78 天、第125 天和第170 天分別取污泥樣品，記為AM1，AM2，AM3 和AM4。 再分別用PBS 溶液沖洗2 ～3 次，于離心管中靜置30 min 后棄去上層清液于-20 ℃冰箱中待用。

1.4 微生物群落組成及豐度測定方法

1.4.1 DNA 提取

根據(jù)FastDNASPIN 試劑盒（MPBiomedicals,Solon,OH,USA） 說明書進行總DNA 抽提；DNA 濃度和純度采用NanoDrop2000 檢測；DNA 提取質(zhì)量采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.2 定量PCR 擴增和Illumina 高通量測序

在細菌16SrRNA 基因V4 區(qū)， 采用通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）進行PCR 擴增，擴增及測序程序依據(jù)閆冰等[3]敘述方法。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用美吉生物平臺對樣品中的微生物進行高通量測序結(jié)果分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 ANAMMOX 顆粒污泥反應器的脫氮性能

ANAMMOX 顆粒污泥反應器快速啟動并運行170 d， 通過調(diào)節(jié)進水基質(zhì)濃度和HRT 來逐步提升進水氮負荷（NLR），階段10 系統(tǒng)實際進水NLR 最高達到了4.05 kg/(m3·d)（以（NH4++NO2-）計），該階段運行穩(wěn)定后，NH4+-N，NO2--N 和TN 平均去除率分別為88.87%，93.09%和84.36%，反應器平均氮去除負荷（NRR）達到3.41 kg/(m3·d)。 反應器運行各階段NH4+-N，NO2--N，NO3--N 進、出水濃度及TN 去除率和氮去除負荷變化情況見圖2。 由圖2 可以看出，階段1， 保持HRT 為12 h， 進水TN 質(zhì)量濃度為210 mg/L。 經(jīng)過31 d 的運行，反應器脫氮性能穩(wěn)步提升，系統(tǒng)運行穩(wěn)定后NH4+-N，NO2--N 和TN 平均去除率分別達到95.71%，95.65%和88.60%， 第31 天出水NH4+-N 和NO2--N 質(zhì)量濃度分別為4.26 和4.79 mg/L，NRR 達到0.38 kg/（m3·d）。 階段2 ～階段10，通過調(diào)控進水TN 濃度和HRT 以提升進水NLR，主要分為“縮短HRT 同時降低進水TN、 縮短HRT 且保持進水TN 不變、增加進水TN 且保持HRT 不變”3 種調(diào)控方式。整個過程反應器表現(xiàn)出良好的脫氮性能，在提升NLR 時，去除率有短暫的下降，但很快即可恢復到較高的去除率。系統(tǒng)的NRR 隨著反應器的運行穩(wěn)步提升， 在HRT 變?yōu)? h 時，NRR 也有短暫的降低，而后又穩(wěn)定提升，最終穩(wěn)定保持在3.41 kg/(m3·d)左右，這與杜帥等[2]在厭氧氨氧化系統(tǒng)的快速啟動研究結(jié)論相似。 此時，ANAMMOX 顆粒污泥反應器脫氮性能良好且穩(wěn)定。

圖2 厭氧氨氧化顆粒污泥培養(yǎng)過程反應器脫氮性能

2.2 基質(zhì)及產(chǎn)物化學計量關(guān)系變化

在ANAMMOX 顆粒污泥反應器啟動及運行過程中，考察了NO2--N 去除量（△NO2--N）與NH4+-N去除量（△NH4+-N）,NO3--N 生成量（△NO3--N）與（△NH4+-N）的平均化學計量關(guān)系比的變化。 化學計量關(guān)系隨時間變化情況見圖3。 由圖3 可以看出，階段1，（△NO2--N）/（△NH4+-N）值低于理論值（1.146），（△NO3--N）/（△NH4+-N） 值前期低于理論值（0.161）[16-17]， 之后上升接近理論值， 說明此時的ANAMMOX 菌受到基質(zhì)沖擊，厭氧氨氧化反應不穩(wěn)定，可能有氨氧化菌（AOB）參與反應，將部分NH4+-N氧化為NO2--N， 同時可能存在短暫的菌體自溶現(xiàn)象， 致使體系內(nèi)反硝化細菌活動， 使生成的部分NO3--N 被還原，導致（△NO2--N）/（△NH4+-N）值和（△NO3--N）/（△NH4+-N）值降低[18]。 階段2 ～階段8，（△NO2--N）/（△NH4+-N）值有所提升并接近理論值，（△NO3--N）/（△NH4+-N）值也在理論值附近，說明此時反應器中厭氧氨氧化為主導脫氮途徑。 階段9 ～階段10，（△NO2--N）/（△NH4+-N）值和（△NO3--N）/（△NH4+-N） 值均高于理論值， 說明隨著負荷的提升，ANAMMOX 菌活性受到抑制， 而在長期進水過程中，容易存在復氧的情況，系統(tǒng)中少量的亞硝酸鹽氧化菌（NOB）將部分NO2--N 氧化為NO3--N。

圖3 化學計量關(guān)系隨時間變化情況

2.3 污泥EPS 含量和粒徑變化

微生物分泌的EPS 有助于促進顆粒污泥的形成，提升系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。ANAMMOX顆粒污泥粒徑的大小是污泥顆粒化程度的重要指示參數(shù)，顆粒化程度高、粒徑大的污泥，具有良好的沉降性能和抗沖擊負荷能力， 可實現(xiàn)生物量的有效保留[18]。 研究在HRT 分別為12 ，6 ，3 和2 h 時測定了污泥中EPS 含量見圖4。 由圖4 可以看出，第10 天～第165 天，EPS 含量逐漸增加，而蛋白質(zhì)是EPS 的主要成分。 蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)由64.48±3.76 mg/g 提高至127.67±2.59 mg/g。 蛋白質(zhì)與多糖質(zhì)量分數(shù)的比值（w（PN）/w（PS））與污泥表面電荷的疏水性直接相關(guān)，w（PN）/w（PS）值由2.78 逐漸增至4.30，提高了污泥間親和力，促進了顆粒污泥的形成。接種污泥是取自實驗室培養(yǎng)的厭氧氨氧化污泥，顏色呈棕黃色，顆粒粒徑在0.3 ～4 mm 范圍內(nèi)。經(jīng)過長期連續(xù)運行，第165 天再次取出污泥， 此時顆粒污泥粒徑在5 ～12 mm 范圍內(nèi)， 且粒徑大于8 mm 的顆粒污泥占比較大， 說明通過提升NLR 可有效刺激ANAMMOX菌分泌胞外聚合物（EPS），EPS 是實現(xiàn)污泥團聚和顆粒化的重要因素[18]。

圖4 污泥中EPS 含量變化

2.4 ANAMMOX 顆粒污泥反應器微生物多樣性分析

2.4.1 微生物多樣性及豐富度分析

通過美吉生物云平臺對樣品中的微生物進行高通量測序結(jié)果分析， 微生物群落豐度和多樣性見表2。 由表2 可以看出， 樣品AM1，AM2，AM3 和AM4的檢測覆蓋率均在99.6%以上，近似為1，可認為該測序結(jié)果囊括了所有物種，具有代表性[2]。

表2 微生物群落豐度和多樣性

Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Ace 指數(shù)和Chao指數(shù)可反映ANAMMOX 顆粒污泥反應器長期運行過程微生物群落多樣性特征。 Shannon 指數(shù)與Simpson 指數(shù)相似， 可用于估算樣本中微生物多樣性。 Shannon 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高，而Simpson 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。 檢測樣品AM1，AM2，AM3 和AM4 的Shannon 指數(shù)值和Simpson 指數(shù)值與杜帥等[2]的研究結(jié)果相似，而與姜瀅等[12]在不同培養(yǎng)條件厭氧氨氧化顆粒污泥性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)差異的研究結(jié)果相比，指數(shù)值較小，說明隨著反應器的運行， 系統(tǒng)內(nèi)的微生物多樣性在減少。 Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)均由CHAO A[19]提出，Ace 指數(shù)用來估計群落中OTU 數(shù)目，是生態(tài)學中估計物種總數(shù)的常用指數(shù)之一，Chao 指數(shù)是用chao1算法估計樣本中所含OTU 數(shù)目的指數(shù)。 Ace 指數(shù)值和Chao 指數(shù)值越大，則說明該樣品包含的物種數(shù)越多。4 個微生物樣品的檢測Ace 指數(shù)值和Chao 指數(shù)值與杜帥等[2]的研究結(jié)果相近，而與劉福長等[20]的研究結(jié)果差值較小，這與之前的分析相符合，微生物群落結(jié)構(gòu)及豐富度呈下降趨勢。

2.4.2 門水平物種相對豐度分析

樣品門水平的微生物群落多樣性見圖5。 將微生物檢測相對豐度大于1%的菌群作為主要分析對象[21]。由圖5 可以看出，ANAMMOX 顆粒污泥反應器優(yōu)勢菌門主要以綠彎菌門（Chloroflexi）、 變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）和 浮霉菌門（Planctomycetes）為主。 反應器在氮負荷提升過程中經(jīng)過長期運行， 浮霉菌門的相對豐度有很大提升，由最初的6.65%增至18.94%。 ANAMMOX 菌所屬的浮霉菌門相對豐度提高， 且反應器脫氮性能逐步提升， 說明實現(xiàn)了厭氧氨氧化反應的長期穩(wěn)定維持。 Chloroflexi 的相對豐度一直保持在較高水平（25.43%～35.93%）， 它的存在將促進細胞聚集，有利于顆粒污泥的形成。 Bacteroidetes 的相對豐度由18.78%降至2.96%，明顯減少，與曹雁等[22]的研究結(jié)果相似。

圖5 門水平物種相對豐度分布

2.4.3 屬水平物種相對豐度分析

屬水平物種相對豐度分布見圖6。 由圖6 可以看出， 樣品 AM1，AM2，AM3 和 AM4 中存在Candidatus_Kuenenia 和Candidatus_Brocadia 2 種ANAMMOX 菌。 其中，Candidatus_Kuenenia 的相對豐度占比由 3.60% 上升至 18.6% ， 而Candidatus_Brocadia 的相對豐度隨著反應器的運行，由2.2%逐漸減至0。 結(jié)果表明，反應器啟動初期的浮霉菌門微生物結(jié)構(gòu)與脫氮效能提升后差別較大， 可能是隨著反應器的長期運行，ANAMMOX 污泥顆粒化加強，Candidatus_Kuenenia 更容易聚集，而Candidatus_Brocadia 更適合在絮狀污泥中生存[23]。

圖6 屬水平物種相對豐度分布

除了浮霉菌門，變形菌門同樣具有脫氮功能，且以Denitratisoma 和Limnobacter 為主要功能微生物屬。 如樣品AM1 所示， 反應器啟動初期，Denitratisoma 和Limnobacter 的相對豐度占比分別為1.84%和10.74%。 經(jīng)過長期連續(xù)性運行，Denitratisoma 的比例有所增加，最終約占9.94%，這可能是反硝化菌利用了反應器中經(jīng)細胞代謝或微生物死亡后的有機物來維持自身生長代謝， 以完成反硝化過程，從而進一步提高系統(tǒng)脫氮效率[12]。 有研究表明，Limnobacter 可削弱外界環(huán)境變化對ANAMMOX 菌的沖擊[3]，其在樣品AM1，AM2 和AM3中占比均在10%以上。

3 結(jié)論

（1）系統(tǒng)進水氮負荷由0.42 kg/（m3·d）提升至3.72 kg/(m3·d)，NH4+-N，NO2--N 和TN 去除率最高分別達到89.37%，91.85%和83.35%， 氮去除負荷由0.29 kg/(m3·d)提升至3.51 kg/(m3·d)。 氮負荷提升可有效刺激ANAMMOX 菌分泌胞外聚合物EPS，有利于污泥團聚，同時縮短HRT 后較大的水力剪切力可促進污泥顆粒化，從而提升厭氧氨氧化脫氮性能。

（2）經(jīng)過長期運行，反應器中Planctomycetes 的相對豐度有很大提升， 由最初的6.65%增至18.94%。 Chloroflexi 的相對豐度一直保持在較高水平（25.43%～35.93%），有利于細胞聚集，在顆粒污泥的形成中起骨架作用。

（3） 樣品 AM1，AM2，AM3 和 AM4中存在Candidatus_Kuenenia 和 Candidatus_Brocadia 2 種ANAMMOX 菌， 但隨著ANAMMOX 污泥顆粒化程度不斷加強， 由于Candidatus_Kuenenia 更容易聚集，其豐度逐漸增加，而Candidatus_Brocadia 逐漸消失。