耐鹽菌的篩選鑒定及其降解性能分析

孫 晴， 陳 平， 李再興， 陳曉飛， 張婉玉， 邢 茜， 祁浩杰

（1.天俱時工程科技集團有限公司， 河北 石家莊 050000；2.河北科技大學， 河北 石家莊 050091)

0 引言

隨著我國工業化進程快速推進， 廢水造成的污染也日益嚴峻[1]。 其中高鹽廢水占廢水總排放量的5%以上，并且以每年2%的速度快速上升[2]。 高鹽廢水是指總鹽(以NaCl 計)質量分數大于或等于1%的廢水，其可使水體富營養化和土地鹽堿化。此類廢水主要來源于石油、造紙、印染、化工、制藥、食品加工等生產領域， 其中含有大量有機污染物和高濃度無機鹽[3-5]。 高鹽、高濃度廢水成分復雜、毒性大、難降解，其治理方法是制約工業發展的瓶頸問題[6]。

目前， 處理高鹽度廢水方法主要包括電化學氧化法、離子交換法、膜分離法、加熱蒸發法和生物處理法[7-9]。化學法和物理法有一定的局限性，如運行成本高，處理效果有限，通常只在特定條件下應用，無法大規模工業化應用；生物處理法無需提前除鹽，也無需稀釋進水，可直接用于含鹽廢水的處理。該方法可減少前期的資金投入和后期的運營成本， 而且無二次污染、節約水資源，是處理廢水的首選方法，也是近年來的環保熱點[10-11]。但鹽度過高容易破壞微生物細胞和胞內生物酶，抑制微生物的生長和代謝，無法達到理想的降解效果[12]。 因此，有研究人員將耐鹽菌投加到活性污泥中或者生物反應器內進行應用。李坤等[13]研究發現，在MBBR 中接入耐鹽菌劑，不僅提高了COD 去除率， 生物膜處理體系也更加穩定，能夠抵抗較高鹽度范圍波動。 代鵬飛等[14]將優勢菌投加到SBR 中發現，COD 平均去除率為72.8%，比未投加微生物組提高了22%。 廖焰焰等[15]從處理醫藥廢水的活性污泥中馴化、 分離出一株高耐鹽菌株發現，該菌株可處理高鹽醫藥廢水，CODcr 去除率可達73.0%。由上可知，耐鹽菌的加入可改善鹽度對微生物的抑制作用， 大幅提升高鹽廢水中有機污染物的降解效率。 高效耐鹽菌在高鹽廢水處理中具有巨大的應用潛力[16]。

從某制藥廠二沉池中取出活性污泥，通過馴化、分離得到3 株耐鹽菌，最終篩選出一株高耐鹽菌。對該菌株進行形態學、 生理生化特性和16S rDNA 分析進行菌株鑒定， 研究不同環境因素對菌株降解性能的影響，并在實際高鹽廢水中進行應用驗證，以期為生物法處理難降解高鹽廢水提供高效菌種資源和技術支持。

1 材料與方法

1.1 培養基

基礎培養基、全培養基、選擇性培養基均參照文獻《微生物學實驗》[17]。 基礎培養基用于細菌培養；全培養基用于細菌富集；選擇性培養基用于細菌性能測定。

1.2 菌株篩選

馴化：實驗搭建反應器模擬MBBR 工藝，模擬廢水中（m(C)∶m(N)∶m(P)=100 ∶5 ∶1）底部曝氣好氧運行。根據COD 去除率和馴化情況逐步提高鹽濃度， 培養至填料掛膜情況良好， 鏡檢可見明顯菌膠團，即得到定向馴化的耐鹽菌群[18-20]。

篩選：用混勻器處理馴化后的污泥液，取上清液稀釋后涂布于基礎培養基上，在溫度為30 ℃下培養至有明顯菌落。 挑取不同單菌落多次劃線培養至得到純化細菌。 梯度配制NaCl 質量分數為0 ～15%的固體基礎培養基。將純化菌株制成菌懸液，稀釋至合適倍數后涂布。 在30 ℃恒溫下培養72 h，用菌落數量表示菌株生長情況[21]。

1.3 菌株鑒定

（1）菌株形態特征和生理生化特性。將菌株接種于基礎培養基上培養，觀察其菌落特征和菌體形態。參照《微生物技術》進行生理生化特性實驗[21]。

（2）菌株16s rDNA 基因序列分析。用DNA 試劑盒提取細菌基因組DNA。 使用16S rDNA 通用引物進 行 PCR 擴增。 擴增引物為27F （5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3） 和 1492R （5 -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3）， 擴增反應體系為50 μL。將擴增產物送上海派森諾基因科技有限公司完成16S rDNA 序列測定[22]。

1.4 菌株生長特性研究

為探究環境因素對復篩菌株的影響， 按照將菌懸液稀釋至108 CFU/mL 接入選擇性培養基， 分別設置好溫度、pH 值、接種量和鹽度梯度，在恒溫培養振蕩器以轉速為190 r/min 培養72 h，每24 h 取樣1次，分別測定OD600值和COD 濃度[23]。并在最適宜單因素條件下，測定細菌生長趨勢[17]。

1.5 菌株降解高鹽廢水的實際應用

從細菌斜面上挑取一環菌苔接入基礎培養基中，200 r/min 搖床培養過夜。 將得到的培養液，稀釋至合適的接種濃度（108 CFU/mL）轉接到全培養基中。 180 r/min 搖床培養24 h 得到放大培養的菌液。

菌株降解高鹽廢水實驗裝置示意見圖1。由圖1可以看出，該裝置采用有機玻璃反應器，有效容積為3 L。 首先將某制藥廠一車間和二車間的高鹽廢水分別加入1 號、2 號反應器中，調節pH 值至設定值，開啟曝氣泵，將DO 質量濃度控制在4 ～5 mg/L。 再將體積分數為5%菌液接入1 號、2 號反應器中， 每隔24 h 測定1 次COD 值。 同時，以普通活性污泥處理一車間和二車間的高鹽廢水作為對照實驗，在3 號、4 號反應器中進行。

圖1 降解高鹽廢水實驗裝置示意

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

污泥馴化啟動初期， 測得NaCl 質量濃度為4 224 mg/L，COD 質量濃度為800 mg/L。 運行60 d后，NaCl 質量濃度達到40 000 mg/L，進水COD 質量濃度為2 000 mg/L，去除率穩定在82.5%以上。 填料掛膜情況良好，鏡檢菌膠團明顯，得到定向馴化的耐鹽菌群。

經過分離純化得到3 株細菌，分別命名為M01，M02，M03。耐鹽性測定實驗結果見表1。由表1 可以看出，菌株M02 在NaCl 質量分數為0 ～12%的培養基上均能生長，說明該菌株具有耐高鹽能力，對鹽度有較寬的耐受范圍。 微生物的耐鹽能力是決定其在高鹽廢水中存活與繁殖的決定性因素，

表1 耐鹽性測定實驗結果%

2.2 菌株鑒定

（1）菌株形態特征和生理生化特性。 菌株M02的形態特征見圖2。 由圖2 可以看出，M02 菌落呈圓形邊緣完整，表面有光澤、光滑、濕潤、易挑起，不透明，呈白色，側面觀察為扁平狀，48 h 內菌落直徑為1.67 ～1.90 mm。 在1 000 倍顯微鏡下觀察菌體形態呈短棒狀，兩端較圓滑，大小約為（2 ～4）μm× （3 ～6）μm。

圖2 菌株M02 的形態特征

菌株M02 生理生化特性見表2。

表2 菌株M02 的生理生化特性

（2）菌株16S rDNA 測序。菌株M02 PCR 電泳圖像見圖3。

圖3 PCR 產物電泳圖像

將測序得到的序列結果用MEGA7.0 軟件構建系統發育樹見圖4。 由圖4 可以看出，M02 核苷酸序列與Stenotrophomonas pavanii 的同源性達到98%，2種菌株親緣關系接近。 但本菌株的形態學特征和理化性質與已經報道的Stenotrophomonas pavanii 存在一定差異[24]，故鑒定為Stenotrophomonas pavanii 屬的一株潛在新菌， 命名為Stenotrophomonas pavanii M02， 于2021年7月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏編號為CGMCC No.22898。

圖4 菌株M02 的系統發育樹

2.3 菌株生長特性研究

溫度對菌株M02 影響情況見圖5。 由圖5 可以看出，當培養溫度為10 ℃時，菌株生長緩慢。隨著溫度升高， 菌株生長繁殖速度迅速提升，COD 去除率隨之升高； 當溫度升至30 ℃時， 細菌增長量最大，COD 最終去除率可達90.9%；當溫度繼續升至40 ℃時， 細菌生長速度明顯減緩，COD 最終去除率也降至63.3%。 說明溫度可顯著影響細菌的合成代謝，當溫度低時，細菌的生長和生化反應速率變慢。 溫度每升高10 ℃，生化反應速率增加一倍[25]。 但溫度不可能無限升高， 因為細胞內蛋白質和核酸等物質對溫度極為敏感，過高溫度將造成不可逆破壞，致使細菌死亡。 因此，確定菌株最適宜生長溫度為30 ℃。

圖5 溫度對菌株M02 的影響

pH 值對菌株M02 影響情況見圖6。由圖6 可以看出，在偏酸性環境內細菌增量較低；在中性偏堿性環境內細菌增量明顯變大， 當pH 值為7 ～8 時，COD 最終去除率均達到91%以上；在堿性環境內細菌生長速度再次減緩， 當pH 值分別為9，10 時，COD 去除率分別降低為85%和78%。 培養環境的pH 值可引起細胞膜電荷的變化，細胞膜電位改變不僅影響細菌對營養物質的吸收還改變了微生物體內各種生化酶的活性。細菌的生長受到抑制，去除率也隨之降低。因此，為保證細菌生長且具有較高的降解潛力，確定最適宜培養pH 值為7 ～8。

圖6 pH 值對菌株M02 的影響

接種量對菌株M02 影響情況見圖7。 由圖7 可以看出， 在培養初期， 接種量超過7%以上的OD600值增長速度明顯高于其他對照組。 隨著培養時間增長，接種量分別為10%和15%的OD600值逐漸減小，COD 去除率持續降低； 接種量為2%～7%的OD600值和COD 去除率穩定增長，在48 h 時COD 去除率分別為62.9%，86.2%，92.2%。 由此說明接種量過小停滯期延長；增大接種量，在前期可提高細菌生長速率，但隨著培養時間延長，單位細菌可利用的基質和溶解氧相應減少出現菌體自溶，且菌體破裂后的胞內物使COD 濃度持續升高。 故在特定范圍內，接種量越大去除效果越好。 因此，確定最適接種量為7%。

圖7 接種量對菌株M02 的影響

鹽度對菌株M02 影響情況見圖8。 由圖8 可以看出， 在不同鹽度環境下，COD 去除率有著顯著差別。 當NaCl 的質量分數為1%～4%時，細菌快速進入對數期，降解性能強，COD 最終去除率超過90%。隨著鹽度增加，菌株適應期延長，經過調整后繼續生長， 但去除率明顯降低。 NaCl 的質量分數為1%～12%時，菌株M02 均可生長且有降解性能，表明細菌耐鹽范圍廣。在低鹽度時，降解性能隨著鹽度的增加而增大； 當NaCl 的質量分數增至7%以上時，高鹽濃度抑制了降解酶活性從而影響細菌的新陳代謝。 同時，在高滲透壓的脅迫下細胞逐漸脫水，細胞質壁分離死亡。 因此，確定最適宜NaCl 的質量分數為1%～4%。

圖8 NaCl 濃度對菌株M02 的影響

最適單因素條件下，細菌生長趨勢見圖9。 由圖9 可以看出， 菌株M02 在2 h 內迅速進入對數期細菌量快速增長，在20 ～96 h 內為穩定期，細菌量保持在3.16×107～3.37×107CFU/mL。 該細菌延遲期短、生長迅速，對數生長期與穩定期相對長，在處理廢水時可快速發揮作用， 持續且穩定地消耗有機污染物[26]。

圖9 菌株M02 生長曲線

2.4 菌株降解高鹽廢水的實際應用

制藥廠2 種廢水的檢測結果見表3。 圖1 實驗裝置中的1 號、3 號反應器內為一車間高鹽廢水，2號、4 號反應器內為二車間高鹽廢水。其中1 號、2 號反應器按照2.3 生長特性研究得到培養條件， 將培養溫度控制在30 ℃， 廢水pH 值調節至7.5， 菌株M02 按照體積分數為7%的接種量分別接入2 個反應器內，曝氣培養運行72 h。3 號、4 號反應器按照活性污泥法曝氣培養運行72 h。

表3 高鹽廢水檢測結果mg·L-1

2 種廢水用細菌M02 和活性污泥法處理的效果對比情況見圖10。 由圖10 可以看出，一車間廢水用菌株M02 處理時，24 h 的COD 去除率為55.3%，48 h 達到最大值92.0%， 而活性污泥法對COD 最大去除率僅為57.8%； 二車間廢水用菌株M02 處理時，COD 去除率在72 h 內達到最大值93.8%，而活性污泥法對COD 最大去除率僅為33.9%。 2 種廢水均為高鹽水，活性污泥法對COD 的去除率均明顯低于菌株M02， 因為高鹽抑制了活性污泥中細菌的新陳代謝，甚至導致菌體死亡從而降低了有機物的降解率，而菌株M02 可在鹽度為1%～12%之間生長且具有降解性能，處理藥廠2 種廢水的降解率均為92%以上， 再次印證該菌株在高鹽條件下能夠有效降解COD。 菌株M02 處理高鹽廢水72 h 時，二車間廢水的去除率比一車間廢水去除率高1.8%，說明在細菌最適耐鹽范圍內，有機物濃度增大，單位微生物可利用的底物增多， 有利于細菌的生長和有機物的去除。同樣2 種廢水用活性污泥處理時，鹽度越高，降解性能越差。 以上說明菌株M02 在高鹽環境中能夠維持自身的新陳代謝， 可有效降低廢水中COD濃度，處理效果顯著優于活性污泥法，適合高鹽工業廢水的處理。

圖10 菌株M02 與普通活性污泥對高鹽廢水降解的比較

3 結論

通過對處理制藥廢水的活性污泥進行馴化、篩選得到一株耐高鹽優勢菌株。經過形態學、生理生化實驗和16S rDNA 序列分析， 確定該菌株為寡養單胞菌屬的一株潛在新菌， 將其命名為Stenotrophomonas pavanii M02，并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號為CGMCC No.22898。

菌株M02 可在NaCl 質量分數為0 ～12%的環境中生長，具有廣譜耐鹽性。采用單因素實驗法研究不同培養條件對菌株降解模擬高鹽廢水的影響，確定最適宜培養條件：pH 值為7 ～8, 溫度為30 ℃, 接種量為7%，NaCl 的質量分數為1%～4%。 該菌株延遲期短，對數生長期與穩定期長，在處理廢水時可快速發揮作用，持續且穩定地消耗有機污染物。

將菌株M02 處理某制藥廠2 個車間的高鹽廢水， 對COD 最大去除率分別為92.0%和93.8%，比活性污泥法對COD 去除率提高34.2%和59.9%。 在實際廢水處理中，該菌株具有高效降解性能，可大幅提高生物法處理難降解高鹽廢水的效果， 對工業廢水降解具有實際應用價值。