夜來香花提取物對肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤生長及凋亡的影響

盧紅梅

（廣西農業職業技術大學，廣西 南寧 530007）

夜來香又名夜香樹，藥用資源非常豐富。前人在體外抗腫瘤研究中發現夜來香提取物具有抗腫瘤作用。目前，對夜香樹花進行體內抗腫瘤作用方面研究較少。本研究旨在探討夜來香花提取物對肝癌H荷瘤小鼠腫瘤增殖的影響作用，以及對肝癌H細胞周期和細胞凋亡的影響，為繼續研究提供依據。

1 實驗材料

1.1 動物

昆明種小鼠，SPF級，數量60只，雌雄各半，每只體重為18~22 g，購買自右江民族醫學院實驗動物中心。

1.2 細胞株

肝癌細胞H購買于上海細胞生物學研究所。

1.3 藥物與試劑

夜來香花提取物（自制），95%乙醇（Ethanol，山東新泰勝源消毒劑有限公司），Rnase（核糖核酸酶，美國sigma試劑公司），環磷酰胺（CTX，江蘇盛迪亞生物醫藥有限公司），PI（碘化丙啶，美國sigma試劑公司），PBS緩沖液（福州飛凈生物科技有限公司）。

1.4 儀器

旋轉蒸發儀（型號RE-2000E，鄭州華特儀器設備有限公司），電子分析天平（型號AG135，瑞士產），流式細胞檢測儀（型號Epricsxl，美國產），離心機（TDL-50B，上海安亭科學儀器廠），冷凍干燥機（ALPHAl-2/LD-Puls，德國CHRIST公司產），循環水式真空泵（型號SHB，鄭州長城科工貿有限公司）。

2 實驗方法

2.1 夜來香花提取物的提取制備

夜來香花采摘于廣西境內，曬干，65%乙醇浸泡3天，浸泡液放置在圓底燒瓶中，用回流提取方式提取2次，每次2 h。循環水式真空泵進行減壓抽濾，合并兩次的過濾液，將過濾液進行減壓蒸餾，濃縮得提取物濃稠膏，再用冷凍干燥機干燥得夜來香花提取物的浸膏粉。稱取浸膏粉，用生理鹽水來溶解和稀釋，設計并配制三組等比增大的不同劑量給藥組，小劑量組為160 mg/kg，中劑量組為320 mg/kg，大劑量組為640 mg/kg。

2.2 肝癌H22荷瘤小鼠模型的建立

接種肝癌H細胞于小鼠腹部，正常喂養，8天后選擇生長良好的小鼠，腹部用酒精消毒后抽取出腹水，抽出的腹水若有大量紅細胞或顏色呈黃色時視為不合格，應棄去不用，合格的腹水應為無絮狀沉淀的乳白色的濃稠液體。于載玻片上滴一滴腹水，瑞氏染色，鏡下計數瘤細胞數量大于95%。再用無菌生理鹽水按1∶4的比例把腹水稀釋成瘤細胞懸液，于左前支腋窩皮下每只小鼠接種0.2 mL瘤細胞懸液。

2.3 對肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

一天后，選擇造模成功的荷瘤小鼠60只，按體重把小鼠隨機并平均分成5組，每組雌雄數量各占一半，5組分別為陰性對照組（生理鹽水組）、陽性對照組（環磷酰胺組）及夜來香花提取物小劑量組、中劑量組、大劑量組。生理鹽水組給予30 mg/kg，環磷酰胺組給予30 mg/kg（用生理鹽水稀釋），小劑量組給予160 mg/kg、中劑量組給予320 mg/kg、大劑量組給予640 mg/kg夜來香花提取物，灌胃給藥，每天1次，連續給藥8天。第9天采用頸椎脫臼法處死小鼠，立即剝出小鼠右腋下的瘤塊，要求剝離干凈，并稱量瘤塊重量，按下列公式計算瘤塊抑制率：腫瘤抑制率（%）=（1- 給藥組平均腫瘤重量/空白組平均腫瘤重量）×100%。

2.4 流式細胞檢測儀測定H22細胞周期及其凋亡率

稱量瘤塊重量后，每組取瘤塊用剪刀剪碎，制配成H腫瘤細胞懸液。尼龍網（200目）過濾，離心機調節轉速為每分鐘1500轉，共離心2次，每次5 min，瘤細胞懸液調配成每升含1.2×10個的濃度。取0.5 mL瘤細胞懸液放入70%乙醇（4 ℃、500 μL）中固定。第2天，在4℃和每分鐘1500轉的轉速下離心5 min，去除固定液，加入500 μL PBS 緩沖液重懸細胞，每管加 Rnase（5 μL、10 mg/mL），37 ℃水浴25 min，再用200目篩過濾除去粘連細胞，加入終濃度為50 μg/mL PI染液，溫室中染色約30 min。用FCM測定H細胞周期各時相細胞的比例和凋亡細胞。

2.5 統計學處理

3 實驗結果

3.1 對肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

夜來香花提取物對H荷瘤小鼠腫瘤生長影響的實驗結果見表1。陽性對照組和夜來香花提取物的小劑量組、中劑量組、大劑量組與陰性對照組相比較，抑瘤率均有提高，其中夜來香花提取物的中劑量組、大劑量組腫瘤抑制率分別達到了40.17%、50.85%，差異非常顯著（均＜0.01），均有統計學意義，且隨著給藥量的加大，3個劑量組對肝癌H荷瘤小鼠的腫瘤生長抑制率逐漸增強，與劑量呈正相關。

表1 夜來香花提取物對H22荷瘤小鼠腫瘤生長影響的實驗結果（±s）

3.2 對H22細胞周期和凋亡的影響

夜來香花提取物對H細胞周期和凋亡的影響見表2。夜來香花提取物的中劑量組、大劑量組對肝癌H細胞周期作用較為明顯。中劑量組的G/G期細胞從32.3%提高到56.5%，S期細胞從58.5%下調到19.0%，G/M期細胞從9.2%提高到24.5%，其凋亡率為27.8%，與陰性對照組比較有顯著性差異（均＜0.05），差異有統計學意義。大劑量組的GG期細胞從32.3%提高到61.2%，S期細胞從58.5%下調到14.9%，G/M期細胞從9.2%提高到23.9%，其凋亡率也較高，為33.5%，與陰性對照組比較有顯著性差異（均＜0.05），差異有統計學意義。G/G期和G/M期的細胞增多，而S期的減少。

表2 夜來香花提取物對H22細胞周期和凋亡的影響

4 討論

目前惡性腫瘤已經成為一些地區人類死亡的主要原因，每年全世界大約有760萬人死于惡性腫瘤。在我國，惡性腫瘤在死因中排第2位，在城市已排首位。全國每年大約有新發病例200萬，死亡150萬人。肝癌在我國男性惡性腫瘤發病率中居第3位，在我國女性惡性腫瘤發病率中居第5位。由于肝癌發展快，易轉移和復發，病死率很高，近年來發病率有上升的趨勢，對患者危害大，因此探索肝癌的防治方法是當前醫藥研究的重要方向。

根據實體瘤療效評價標準，腫瘤抑制率＜40%為無療效；腫瘤抑制率≥40%，并經統計學分析有顯著性差異時，認為該藥有一定的療效，實驗需重復1次以確定療效。本實驗中夜來香花提取物中劑量組、大劑量組抑瘤率分別達到了40.17%、50.85%，相比陰性對照組均具有顯著性差異（均＜0.01），差異均有統計學意義，且隨著給藥量的加大，3個劑量組的腫瘤生長抑制率逐漸增強，與劑量呈正相關，顯示其對小鼠肝癌H細胞的生長增殖有較好的抑制作用。

細胞凋亡是一種由基因調控的細胞主動死亡過程，是機體的正常細胞在受到生理或病理刺激后啟動的一種主動死亡過程，抗腫瘤藥物作用大多數通過各種細胞因子或藥物誘導敏感腫瘤細胞發生凋亡從而實現其抑瘤作用。流式細胞檢測儀檢測結果表明，夜來香花提取物中劑量組、大劑量組對H細胞周期影響明顯，凋亡率也較高，分別為27.8%、33.5%，與陰性對照組比較差異顯著（均＜0.05），均具有統計學意義。究其原因可能是通過阻斷肝癌H細胞由G/ G期進入S期，從而誘導細胞凋亡。

綜上所述，夜來香花提取物抑制小鼠體內H細胞生長增殖可能與誘導細胞凋亡有關。本實驗為夜香樹花將來的繼續研究、開發和利用提供一定的理論依據。