沙鞭轉(zhuǎn)錄組簡單重復(fù)序列(SSR)位點(diǎn)特征分析

毛軒睿, 劉玉萍, 蘇 旭,2,3,4*, 富 貴, 陳金元, 鄭長遠(yuǎn), 劉 濤,呂 婷, 張 雨, 胡夏宇, 楊 萍

(1. 青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 青海 西寧 810008； 2. 青海師范大學(xué)高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院， 青海 西寧 810016；3. 青海師范大學(xué)青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810008； 4. 青海師范大學(xué)青藏高原地表過程與生態(tài)保育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810008； 5. 青海師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院， 青海 西寧 810008)

沙鞭(Psammochloavillosa)是禾本科(Poaceae)、沙鞭屬(Psammochloa)的一種具長根狀莖的多年生草本植物，主要分布在我國陜西、內(nèi)蒙古、青海、甘肅、寧夏等地，通常生于海拔900～2 900 m的沙地和荒漠中[1-2]。沙鞭是一種良好的固沙植物，具有較強(qiáng)的耐旱、耐寒、耐堿、抗風(fēng)沙和抗病能力[3]。此外，沙鞭富含高品質(zhì)蛋白質(zhì)，因而是畜牧業(yè)上重要的優(yōu)良牧草[4]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)沙鞭的研究主要集中于形態(tài)特征[5-8]、生理特性[9-10]、細(xì)胞性狀[11]、生態(tài)適應(yīng)性[12-14]、遺傳多樣性[15]及種質(zhì)資源收集[16]等領(lǐng)域。譬如，董鳴等[5]通過對(duì)根莖禾草沙鞭與賴草切斷根莖生長狀態(tài)的比較，發(fā)現(xiàn)沙鞭的克隆特性使其在干旱貧瘠環(huán)境中具有更強(qiáng)的生存能力；呂婷等[7]對(duì)沙鞭50個(gè)代表種群葉表皮微形態(tài)特征的觀察，發(fā)現(xiàn)沙鞭種群葉表皮氣孔密度隨環(huán)境干旱程度增加而增加，認(rèn)為這種結(jié)構(gòu)有利于減少體內(nèi)水分散失，是對(duì)荒漠環(huán)境的一種微觀形態(tài)學(xué)解剖特征性適應(yīng)；黃振英等[10]對(duì)沙鞭不同深度沙層中種子萌發(fā)情況和幼苗出土特性的研究，發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)率和幼苗出土率均隨種子被埋深度增加而降低；王亞男等[11]通過對(duì)內(nèi)蒙古高原6個(gè)沙鞭居群染色體核型的分析，發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目均為2n=2x=46，具正中部著絲粒、中部著絲粒、亞中部著絲粒和亞端部著絲粒染色體，核型類型為1A，2A，1B和2B型，核型對(duì)稱性較高，進(jìn)化程度較為原始；賀學(xué)禮等[13]通過探討叢枝菌根(Arbuscularmycorrhiza，AM)真菌時(shí)間和空間分布及侵入群落間隔空地前后對(duì)沙鞭AM真菌的影響，發(fā)現(xiàn)沙鞭與AM真菌可形成良好的共生關(guān)系，沙鞭的克隆生長對(duì)土壤AM真菌的活動(dòng)和時(shí)空分布有顯著影響，AM真菌孢子密度和結(jié)構(gòu)定殖率在沙鞭侵入群落間隔空地前后發(fā)生顯著變化；呂婷[15-16]綜合利用表型性狀和DNA分子標(biāo)記分析了沙鞭的遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其表型多樣性豐富，居群間遺傳變異大于居群內(nèi)，且居群間遺傳分化顯著。然而，目前尚未見關(guān)于沙鞭三代全長轉(zhuǎn)錄組簡單重復(fù)序列(SSR)位點(diǎn)特征的研究報(bào)道。

簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat，SSR)又稱微衛(wèi)星序列(microsatellite)，是研究動(dòng)植物基因遺傳多樣性的一種重要分子標(biāo)記[17]。真核生物基因組中，SSR常由2～6個(gè)重復(fù)、均勻分布的核苷酸片段串聯(lián)組成，具有操作簡便、共顯性遺性、多態(tài)性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[18]。近年來，SSR分子標(biāo)記在植物系統(tǒng)進(jìn)化[19]、遺傳多樣性[20-21]、群體遺傳結(jié)構(gòu)[21]及動(dòng)態(tài)進(jìn)化歷史[22]等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。譬如，尹航等[19]從短芒大麥(Hordeumbrevisubulatum)214 676條Unigene序列中檢測到24 877個(gè)SSR位點(diǎn)，成功設(shè)計(jì)20 802對(duì)引物，認(rèn)為短芒大麥轉(zhuǎn)錄組SSR開發(fā)有較大可能性，為將來SSR分子標(biāo)記開發(fā)、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和輔助育種等提供了參考；李正玲等[20]利用SSR分子標(biāo)記分析了河南省白麥、紅和尚頭、三月黃、白和尚頭等15組相同名稱地方小麥(Triticumaestivum)品種組間和組內(nèi)的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)小麥地方品種具有豐富的遺傳多樣性，相同名稱地方小麥品種間有同名同質(zhì)和同名異質(zhì)存在；徐金青等[21]通過對(duì)青稞(Hordeumvulgare)轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)特征的分析，發(fā)現(xiàn)其含有的SSR位點(diǎn)序列與生物基礎(chǔ)代謝密切相關(guān)；王恒波等[22]利用MISA軟件挖掘了甘蔗(Sacchrumspp.)的SSR位點(diǎn)，并分析了分布特征和多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)甘蔗SSR位點(diǎn)單核苷酸重復(fù)基元中A/T占比最高，認(rèn)為禾本科植物基因組富含A/T基元。據(jù)此，本研究采用MISA軟件對(duì)沙鞭三代轉(zhuǎn)錄組全長序列SSR位點(diǎn)進(jìn)行搜索，并分析其組成類型和分布特征，闡明沙鞭轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)特征，旨在為今后沙鞭SSR引物開發(fā)、遺傳多樣性分析和新基因挖掘等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年，赴甘肅省武威市民勤縣(103.65° N，39.17° E，海拔1 250 m)采集生長良好的沙鞭新鮮健康葉片，迅速用錫箔紙包裹后液氮中速凍，用于RNA提取和測序。憑證標(biāo)本存放于中國科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館(HNWP)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1總RNA提取、建庫及數(shù)據(jù)評(píng)估 采用改良的CTAB法[23-24]提取樣品總RNA，經(jīng)純度和濃度檢測合格后等物質(zhì)的量混合，采用PacBio Sequel測序平臺(tái)進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序、文庫構(gòu)建和數(shù)據(jù)評(píng)估。原始數(shù)據(jù)下機(jī)后利用SMRTlink軟件獲得Subreads序列，對(duì)其校正后產(chǎn)生環(huán)形一致性序列即CCS；根據(jù)CCS是否含有3′和5′引物及PloyA特征，將其劃分為全長序列(FL，F(xiàn)ull length)和非全長序列(NFL，Non-full length)，并分類找出全長非嵌合序列(FLNC，F(xiàn)ull-length non-chimeric)；采用同種類型聚類法(ICE，Iterative isoform-clustering)將相似的FLNC序列聚成一簇，得到Cluster，每個(gè)Cluster獲得一條一致性序列，結(jié)合非全長序列對(duì)其進(jìn)行校對(duì)(Polishing)，篩選得到高質(zhì)量序列用于后續(xù)分析。

1.2.2轉(zhuǎn)錄組SSR微衛(wèi)星序列搜索和篩選 使用MISA(Microsatellite identification tool)軟件檢測轉(zhuǎn)錄本Unigene序列中的SSR位點(diǎn)[25]，獲得單核苷酸(Mononucleotide)、二核苷酸(Dinucleotide)、三核苷酸(Trinucleotide)、四核苷酸(Tetranucleotide)、五核苷酸(Pentanucleotide)和六核苷酸重復(fù)(Hexanucleotide)及復(fù)合型SSR位點(diǎn)(Number of composite SSR loci)序列；對(duì)SSR位點(diǎn)檢測以“單堿基重復(fù)10次及以上，二堿基重復(fù)6次及以上，三堿基、四堿基、五堿基和六堿基重復(fù)5次及以上”為篩選標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)2個(gè)SSR間距離小于100 bp時(shí)組合成1個(gè)復(fù)合微衛(wèi)星。

1.2.3轉(zhuǎn)錄組SSR引物設(shè)計(jì) 基于上述篩選的SSR位點(diǎn)信息，采用Primer3軟件批量設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，并對(duì)引物進(jìn)行篩選，即二堿基重復(fù)次數(shù)10次以上，三堿基、四堿基、五堿基、六堿基重復(fù)次數(shù)6次以上，GC含量40%～60%，退火溫度(Tm)50～65℃，3′端最后5個(gè)堿基至少含一個(gè)G或C(不超過3個(gè))，引物長度17～28 bp(小于30 bp)，上游和下游引物Tm差值≤5℃，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度介于150～350 bp。

1.2.4含SSR位點(diǎn)Unigene序列的KOG和GO功能分類 運(yùn)用BlastX軟件將沙鞭轉(zhuǎn)錄組中含SSR位點(diǎn)的Unigenes序列比對(duì)到NR蛋白(Non-redundant protein database)和KOG數(shù)據(jù)庫(Eukaryotic ortholog groups)；采用Blast2GO軟件和WEGO在線平臺(tái)(https://wego.genomics.cn/)對(duì)NR注釋到的Unigene序列進(jìn)行注釋信息分析和GO功能富集分類，并分析其功能分布特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組中SSR分布和特征

通過對(duì)去冗余沙鞭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，本研究共得到184 076條Unigenes，平均和總長度分別為2 461 bp和453 051 607 bp；運(yùn)用MISA軟件搜索到分布于56 824條Unigenes上的93 563個(gè)SSR重復(fù)序列，SSR發(fā)生頻率(含SSR位點(diǎn)Unigene數(shù)占Unigene總數(shù)比例)為30.87%、出現(xiàn)頻率(SSR位點(diǎn)數(shù)占Unigene總數(shù)比例)為50.83%；轉(zhuǎn)錄組的Unigene序列平均每4 842 bp出現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)，有17 120個(gè)Unigenes包含1個(gè)以上SSR位點(diǎn)，復(fù)合型SSR位點(diǎn)有9 198個(gè)(表1)，說明沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)信息分布廣且豐富。

表1 沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR分布及特征Table 1 The distribution and characteristics of SSR loci in transcriptomes of Psammochloa villosa

2.2 轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型

本研究結(jié)果表明，沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型較為豐富，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)均有呈現(xiàn)，各重復(fù)類型數(shù)目差異較大，但以單核苷酸至三核苷酸重復(fù)為主，占總SSR位點(diǎn)的98.06%(表2)。其中，單核苷酸重復(fù)最多(50 027)，占比53.47%，總長度為510 241 bp，平均每9 060 bp核苷酸出現(xiàn)一個(gè)單核苷酸重復(fù)序列；三核苷酸次之(26 112)，占比27.91%，總長度為376 377 bp，平均每17 350 bp有一個(gè)三核苷酸重復(fù)序列；二核苷酸最少(15 609)，占比16.68%，總長度為204 198 bp，平均每29 030 bp出現(xiàn)一個(gè)二核苷酸重復(fù)序列；四、五、六核苷酸重復(fù)序列類型極少，僅占1.94%，其中五核苷酸重復(fù)僅有317，占比僅為0.34%。此外，重復(fù)類型不同的SSR位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率也存在較大差異，單核苷酸重復(fù)類型至六核苷酸重復(fù)類型的SSR出現(xiàn)頻率依次為27.18%，8.48%，14.19%，0.56%，0.17%和0.25%，其中單核苷酸重復(fù)類型的SSR出現(xiàn)頻率最高，每100條Unigene含SSR位點(diǎn)數(shù)高達(dá)27.18個(gè)，五核苷酸重復(fù)類型的SSR出現(xiàn)頻率最低，每100條Unigene僅含0.17個(gè)SSR位點(diǎn)。

表2 沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)重復(fù)類型、數(shù)量及分布Table 2 The repeating type,number,and distribution of SSR loci in transcriptomes of Psammochloa villosa

2.3 轉(zhuǎn)錄組SSR基元類型分析

沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR基元類型分析結(jié)果表明，SSR重復(fù)基元類型有168個(gè)，不同重復(fù)次數(shù)形成的SSR位點(diǎn)數(shù)93 563個(gè)(圖1和表3)。其中，單核苷酸重復(fù)有2種基元類型，(A/T)n基元類型為主要類型，形成39 544個(gè)SSR位點(diǎn)，占同類基元SSR位點(diǎn)的79.05%，為總SSR位點(diǎn)的42.26%；二核苷酸重復(fù)有4種基元類型，優(yōu)勢基元類型為(AG/CT)n，形成8 691個(gè)SSR位點(diǎn)(59.68%，9.29%)；三核苷酸重復(fù)有10種基元類型，基元類型中SSR位點(diǎn)最多的是(CCG/CGG)n，形成9 175個(gè)SSR位點(diǎn)(35.14%，9.81%)，其次為(AGC/CTG)n(22.7%，6.33%)，形成5 927個(gè)SSR位點(diǎn)，(AGG/CCT)n基元類型形成SSR位點(diǎn)最少，形成4 129個(gè)SSR位點(diǎn)(15.81%，4.41%)；四核苷酸重復(fù)有31種基元類型，形成SSR位點(diǎn)較多的基元類型依次為(AGCG/CGCT)n,(ATCC/ATGG)n,(ACGC/CGTG)n，分別含有256(24.85%，0.27%)、163(15.83%，0.17%)和118(11.46%，0.13%)個(gè)SSR位點(diǎn)；五核苷酸重復(fù)有42種基元類型，SSR位點(diǎn)形成較多的基元類型依次為(AGAGG/CCTCT)n,(AGGGG/CCCCT)n和(ACTCG/AGTCG)n，分別形成60(18.93%，0.06%),27(8.52%，0.03%)和25(7.89%，0.03%)個(gè)SSR位點(diǎn)；六核苷酸重有基元類型79種，形成SSR位點(diǎn)較多的基元類型依次為(ACCAGC/CTGGTG)n,(AGGCGG/CCGCCT)n,(AC-AGCC/CTGTGG)n，(ACGGCG/CCGTCG)n,(AGA-GGG/CCCTCT)n和(ACCGCC/CGGTGG)n，分別形成104(22.22%，0.11%),36(7.69%，0.04%),27(5.77%，0.03%),18(3.85%，0.02%),18(3.85%，0.02%)和17(3.63%，0.02%)個(gè)SSR位點(diǎn)。

本研究結(jié)果還顯示，不同基元類型的SSR位點(diǎn)數(shù)差異較大，單核苷酸重復(fù)中(A/T)n基元的SSR發(fā)生頻率最高為21.48%；30個(gè)基元類型形成的SSR位點(diǎn)發(fā)生頻率最低，僅含1個(gè)SSR序列，其中四核苷酸基元2個(gè)、五核苷酸基元5個(gè)、六核苷酸基元23個(gè)。從基元數(shù)量分布看，沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR基元類型隨SSR基元堿基數(shù)增加而增加，而SSR位點(diǎn)數(shù)則隨基元堿基數(shù)增加而下降(圖1和表3)。

圖1 沙鞭轉(zhuǎn)錄組不同重復(fù)類型優(yōu)勢基元SSR位點(diǎn)數(shù)分布Fig.1 The quantitative distribution of SSR loci of preponderant motifs in different repeat types of transcriptomes of Psammochloa villosa

表3 沙鞭轉(zhuǎn)錄組不同重復(fù)基元SSR位點(diǎn)數(shù)及頻率Table 3 The quantities and frequencies of different motif SSR loci in transcriptomes of Psammochloa villosa

續(xù)表3

2.4 轉(zhuǎn)錄組SSR基元重復(fù)次數(shù)分析

SSR基元重復(fù)次數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)5次重復(fù)基元出現(xiàn)頻率最高，共16 553個(gè)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的17.69%，其次為10次重復(fù)(14.58%),6次重復(fù)(11.68%)和11次重復(fù)(7.58%)；SSR位點(diǎn)重復(fù)5～10次的有52 747個(gè),占56.38%，重復(fù)11～20次的有26 315個(gè),占28.13%，重復(fù)21～30次的有6 938個(gè),占7.42%，重復(fù)31～40次的有2 209個(gè),占2.36%，重復(fù)41～50的有1 349個(gè),占1.44%，重復(fù)51～60次的有938個(gè),占1.00%；SSR數(shù)量隨重復(fù)次數(shù)增加而降低，未呈現(xiàn)于圖中的四堿基、五堿基和六堿基重復(fù)也具有相同的趨勢，隨重復(fù)次數(shù)增多而降低(圖2)。

圖2 沙鞭轉(zhuǎn)錄組中SSR基元重復(fù)次數(shù)Fig.2 Repeat times of SSR motifs in transcriptomes of Psammochloa villosa

SSR基元重復(fù)次數(shù)類型分布分析，發(fā)現(xiàn)沙鞭轉(zhuǎn)錄組中不同重復(fù)次數(shù)形成的SSR位點(diǎn)隨基元序列長度呈現(xiàn)較大差異；不同基元類型構(gòu)成的SSR位點(diǎn)中，重復(fù)次數(shù)最小的最多，隨基元序列長度增長，重復(fù)次數(shù)類型總體呈現(xiàn)下降趨勢(表4)。單核苷酸重復(fù)次數(shù)類型分布最廣，介于10～40，有60種類型，不同重復(fù)次數(shù)類型形成的SSR位點(diǎn)數(shù)量差異較大，其中最小重復(fù)次數(shù)(10次)形成的SSR位點(diǎn)占比最高，占所有單核苷酸SSR序列的24.56%，最大重復(fù)次數(shù)(40次)占所有單核苷酸SSR序列的0.34%，有171個(gè)SSR位點(diǎn)；而重復(fù)次數(shù)類型最少的五核苷酸則介于5～8，有16種，其中5次為最小重復(fù)次數(shù)，形成最多的SSR位點(diǎn)(255個(gè))，占五核苷酸重復(fù)序列總SSR位點(diǎn)的79.50%，最大重復(fù)次數(shù)為8次，形成3個(gè)SSR位點(diǎn)，占比1.19%。重復(fù)次數(shù)介于10～40基元重復(fù)次數(shù)類型詳見表4。

表4 沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR基元重復(fù)次數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 4 The statistics of repetition times for SSR motifs in transcriptomes of Psammochloa villosa

2.5 轉(zhuǎn)錄組不同基元類型SSR位點(diǎn)長度分析

沙鞭轉(zhuǎn)錄組不同基元SSR位點(diǎn)長度統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)不同類型基元SSR位點(diǎn)包含的長度類型不同，但主要集中于12～36 bp，二核苷酸至六核苷酸在此長度范圍內(nèi)共包含43 085個(gè)SSR位點(diǎn)，占統(tǒng)計(jì)SSR位點(diǎn)的98.98%(統(tǒng)計(jì)重復(fù)次數(shù)5～40 SSR數(shù)量，位點(diǎn)總數(shù)為43 531)，且SSR位點(diǎn)長度與數(shù)目呈負(fù)相關(guān)(圖3和表5)。三核苷酸基元構(gòu)成的SSR位點(diǎn)長度在12～36 bp數(shù)量最多，為26 051個(gè)，占三核苷酸SSR位點(diǎn)總數(shù)的99.77%；二核苷酸次之(15 250個(gè)，97.73%)；五核苷酸最少(314個(gè)，99.05%)；四核苷酸和六核苷酸分別為1 028個(gè)(99.81%)和442個(gè)(94.44%)。

圖3 沙鞭轉(zhuǎn)錄組不同基元類型SSR位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Fig.3 The statistics of different motif SSR loci in transcriptomes of Psammochloa villosa

表5 沙鞭不同基元和重復(fù)次數(shù)SSR位點(diǎn)長度分析Table 5 Statistics of the length of different motifs and repetition time SSR loci of Psammochloa villosa

2.6 轉(zhuǎn)錄組SSR引物設(shè)計(jì)

本研究采用Primer3軟件批量設(shè)計(jì)SSR引物，共設(shè)計(jì)43 620對(duì)引物，基于自動(dòng)和人工篩選得到31對(duì)符合要求的引物，其中二堿基重復(fù)引物11對(duì)、三堿基重復(fù)引物19對(duì)、四堿基重復(fù)引物1對(duì)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為173～277 bp(表6)。

表6 31對(duì)SSR引物信息Table 6 Information of 31 pairs of SSR primers

續(xù)表6

2.7 轉(zhuǎn)錄組中含SSR的Unigene功能注釋及分類

通過對(duì)56 824條含SSR的Unigenes的GO和KOG功能注釋，本研究發(fā)現(xiàn)KOG注釋將29 444條Unigenes歸為24類(圖4)，且含SSR的基因序列功能豐富。其中，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶功能類占比最大，有3 757個(gè)Unigenes，占KOG注釋Unigenes總數(shù)的12.76%；其次是一般功能預(yù)測(3 511，11.92%)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(3 468，11.78%)；細(xì)胞外結(jié)構(gòu)占比最少，僅有9個(gè)Unigenes，占比0.03%。GO注釋將10 864個(gè)Unigenes歸為細(xì)胞組成(Cellular component)、分子功能(Molecular function)和生物學(xué)過程(Biological process)的41個(gè)功能類群(圖5)，其中主要功能類群為結(jié)合、催化活性、代謝過程、細(xì)胞過程、細(xì)胞和細(xì)胞組分。

圖4 沙鞭轉(zhuǎn)錄組含SSR位點(diǎn)的Unigene序列KOG功能分類Fig.4 KOG functional classification of unigenes containing SSR loci in transcriptomes of Psammochloa villosa注：1-核糖核酸處理和修飾；2-碳水化合物運(yùn)輸和代謝；3-能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換；4-細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分割；5-氨基酸運(yùn)輸和代謝；6-核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；7-輔酶運(yùn)輸和代謝；8-脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝；9-翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成；10-轉(zhuǎn)錄；11-復(fù)制、重組和修復(fù)；12-細(xì)胞壁，膜，包膜生物發(fā)生；13-細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；14-翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶；15-無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；16-次級(jí)代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝；17-一般功能預(yù)測；18-未知功能；19-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；20-細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)；21-防御機(jī)制；22-細(xì)胞外結(jié)構(gòu)；23-核結(jié)構(gòu)；24-細(xì)胞骨架Note:1-RNA processing and modification;2-Carbohydrate transport and metabolism;3-Energy production and conversion;4-Cell cycle control,cell division,chromosome partitioning;5-Amino acid transport and metabolism;6-Nucleotide transport and metabolism;7-Coenzyme transport and metabolism;8-Lipid transport and metabolism;9-Translation,ribosomal structure and biogenesis;10-Transcription;11-Replication,recombination and repair;12-Cell wall/membrane/envelope biogenesis;13-Cell motility;14-Posttranslational modification,protein turnover,chaperones;15-Inorganic ion transport and metabolism;16-Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism;17-General function prediction only;18-Function unknown;19-Signal transduction mechanisms;20-Intracellular trafficking,secretion,and vesicular transport;21-Defense mechanisms;22-Extracellular structures;23-Nuclear structure;24-Cytoskeleton

圖5 沙鞭轉(zhuǎn)錄組含SSR位點(diǎn)的Unigene序列GO功能分類Fig.5 GO functional classification of unigenes containing SSR loci in transcriptomes of Psammochloa villosa注：1-細(xì)胞；2-細(xì)胞成分；3-細(xì)胞器；4-膜；5-膜成分；6-細(xì)胞器成分；7-蛋白質(zhì)復(fù)合物；8-超分子復(fù)合物；9-膜封閉腔；10-細(xì)胞外組分；11-擬核；12-催化活性；13-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性；14-結(jié)合；15-分子傳感器活性；16-抗氧化活性；17-分子功能調(diào)節(jié)器；18-結(jié)構(gòu)分子活性；19-轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性；20-過時(shí)信號(hào)傳感器活動(dòng)；21-定位；22-生物調(diào)節(jié)；23-代謝過程；24-細(xì)胞過程；25-發(fā)育過程；26-多細(xì)胞生物過程；27-生殖過程；28-繁殖；29-生物過程的調(diào)節(jié)；30-多生物體過程；31-生物過程的負(fù)調(diào)控；32-應(yīng)激反應(yīng)；33-信號(hào)；34-免疫系統(tǒng)過程；35-生物過程的正調(diào)控；36-生長；37-細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生；38-節(jié)律過程；39-碳利用；40-移動(dòng)；41-細(xì)胞增殖Note:1-cell;2-cell part;3-organelle;4-membrane;5-membrane part;6-organelle part;7-protein-containing complex;8-supramolecular complex;9-membrane-enclosed lumen;10-extracellular region;11-nucleoid;12-catalytic activity;13-transprter activity;14-binding;15-molecular transducer activity;16-antioxidant activity;17-molecular function regulator;18-structural molecule activity;19-transcription regulator activity;20-obsolete signal transducer activity;21-localization;22-biological regulation;23-metabolic process;24-cellular process;25-developmental process;26-multicellular organismal process;27-reproductive process;28-reproduction;29-regulation of biological process;30-multi-organism process;31-negative regulation of biological process;32-response o stimulus;33-signaling;34-immune system process;35-positive regulation of biological process;36-growth;37-cellular component organization or biogenesis;38-rhythmic process;39-carbon utilization;40-locomotion;41-cell proliferation

3 討論

先前研究表明，三代全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)無需打斷和組裝，具有測序讀長長，能直接讀取反轉(zhuǎn)錄全長cDNA等[26]，尤其能有效獲取高質(zhì)量單個(gè)RNA分子的全部序列，精準(zhǔn)得到mRNA的同源異構(gòu)體、單堿基變異、可變剪接、同源基因和等位基因等信息，因而現(xiàn)已成為DNA測序技術(shù)未來發(fā)展的主要方向[27]。本研究基于PacBio Sequel測序平臺(tái)，獲得沙鞭的全長轉(zhuǎn)錄組含184 076條Unigene序列，去冗余后得到93 563個(gè)SSR重復(fù)序列，其分布于56 824條Unigene序列上，SSR發(fā)生頻率為30.87%。徐金青等[21]通過對(duì)青稞轉(zhuǎn)錄組9 576條Unigene序列分析，發(fā)現(xiàn)SSR位點(diǎn)11 930個(gè)，發(fā)生頻率為16.49%；王恒波等[22]在甘蔗中發(fā)現(xiàn)27 241個(gè)SSR位點(diǎn)，平均每1.08個(gè)基因出現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)，發(fā)生頻率為14.02%；朱永群等[27]通過對(duì)禾本科牧草蘇丹草(Sorghumsudanense)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的綜合分析，發(fā)現(xiàn)SSR位點(diǎn)發(fā)生頻率為16.82%，這些結(jié)果顯著低于本研究中SSR位點(diǎn)的發(fā)生頻率，因此我們認(rèn)為沙鞭轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的發(fā)生頻率較高，位點(diǎn)數(shù)量豐富，具有較高的開發(fā)潛能。

沙鞭轉(zhuǎn)錄組含有豐富的SSR重復(fù)類型，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)均存在，以單核苷酸、二核苷酸及三核苷酸重復(fù)為主，其占總SSR位點(diǎn)的98.06%，其中以單核苷酸重復(fù)最多(50 027，53.47%)。王恒波等[22]通過對(duì)甘蔗轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型的分析，發(fā)現(xiàn)其以單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)為主要的SSR重復(fù)類型，占比分別為40.67%、11.97%和23.67%，這與本研究結(jié)果基本一致，尤其絕大多數(shù)模式植物如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[29]、棉花(Gossypiumspp.)[30]和水稻(Oyrzasativa)[29]中也獲得類似結(jié)論，從而進(jìn)一步說明本研究的結(jié)果是準(zhǔn)確和合理的。同時(shí)，本研究顯示沙鞭轉(zhuǎn)錄組含有168個(gè)SSR重復(fù)基元類型，不同重復(fù)次數(shù)下形成的SSR位點(diǎn)數(shù)共93 563個(gè)；基元類型隨SSR基元堿基數(shù)增加而增加，SSR位點(diǎn)數(shù)隨SSR基元堿基數(shù)增加而降低。其中，單核苷酸重復(fù)的2種基元類型中(A/T)n占絕對(duì)優(yōu)勢，形成39 544個(gè)SSR位點(diǎn)，占同類基元SSR位點(diǎn)的79.05%，占總SSR位點(diǎn)的42.26%。先前研究表明，高粱(Sorghumbicolor)[31](65.60%)、水稻[31](64.40%)和甘蔗[22](84.78%)等3種禾本科植物轉(zhuǎn)錄組中單核苷酸重復(fù)基元也是(A/T)n占優(yōu)勢，據(jù)此我們認(rèn)為沙鞭轉(zhuǎn)錄組中SSR基元應(yīng)具有某種堿基偏好性，富含(A/T)n基元類型可能是禾本科植物的共同特點(diǎn)。二核苷酸重復(fù)有4種類型，(AG/CT)n為優(yōu)勢基元類型；三核苷酸重復(fù)有10種基元類型，優(yōu)勢基元類型為(CCG/CGG)n、(AGC/CTG)n和(AGG/CCT)n，這與青稞轉(zhuǎn)錄組中SSR以(AG/CT)n[21]為優(yōu)勢基元、玉米(Zeamays)[32]中以(CCG/CGG)n和(AGG/CCT)n為優(yōu)勢基元相同，這也得到先前諸多學(xué)者[30]認(rèn)為大多數(shù)單子葉植物轉(zhuǎn)錄組中二核苷酸和三核苷酸的優(yōu)勢重復(fù)基元分別為(AG/CT)n和(CCG/CGG)n觀點(diǎn)的證實(shí)。此外，沙鞭SSR不同基元長度和重復(fù)次數(shù)類型分布分析，我們發(fā)現(xiàn)沙鞭轉(zhuǎn)錄組中SSR長度主要集中于12～36 bp，長度≥20 bp的SSR序列共20 364個(gè)，占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的23.09%，12～20 bp的占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的55.82%，其與SSR位點(diǎn)數(shù)目呈負(fù)相關(guān)；隨SSR基元序列長度增加，重復(fù)次數(shù)類型總體呈下降趨勢，顯然沙鞭SSR具有較高的多態(tài)性，因此SSR分子標(biāo)記具有較高的開發(fā)價(jià)值和潛能。

另外，本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出31對(duì)符合要求的SSR引物；同時(shí)，對(duì)含SSR的Unigene序列進(jìn)行了生物功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其功能主要集中于翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、催化活性和代謝過程，翻譯后修飾是植物細(xì)胞快速響應(yīng)外界環(huán)境過程的重要生物學(xué)過程，通過將磷酸基、甲硫氨酸等多樣化基團(tuán)共價(jià)連接到靶蛋白上，來調(diào)節(jié)靶蛋白的活性和定位，控制靶蛋白與其它蛋白間的相互作用，致使靶蛋白質(zhì)具有更加復(fù)雜和完善的結(jié)構(gòu)與功能，從而提高植物的耐逆性；植物蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)也是外界脅迫條件下植物維持自身正常新陳代謝和生物功能的必要條件。由此看來，研究沙鞭轉(zhuǎn)錄組中功能性SSR不僅可為其耐逆適應(yīng)性研究提供參考數(shù)據(jù)，而且也可為新基因開發(fā)提供理論支撐。

4 結(jié)論

本研究獲得沙鞭93 563個(gè)SSR重復(fù)序列，發(fā)生頻率為30.87%，SSR位點(diǎn)數(shù)量豐富，表現(xiàn)出較高的多態(tài)性潛能；轉(zhuǎn)錄組中單核苷酸重復(fù)以(A/T)n為優(yōu)勢基元，可能與堿基偏好性有關(guān)；含SSR的Unigene功能主要集中于翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶、結(jié)合、催化活性、代謝過程等，推測與沙鞭有較強(qiáng)耐逆性有關(guān)。本研究認(rèn)為進(jìn)行沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)特征分析可為將來沙鞭SSR引物開發(fā)、遺傳多樣性與親緣關(guān)系探討乃至新基因發(fā)現(xiàn)等提供重要參考依據(jù)。