硒引發對不同品種紫花苜蓿種子抗氧化特性的影響

王 勃， 王聰聰， 夏方山， 陳奕霖， 趙 萍， 朱慧森

(山西農業大學草業學院， 山西 太谷 030801)

硒是對人類和動物身體健康至關重要的必需微量元素，其含量不足會導致機體免疫下降和內分泌失調等多種關聯疾病的發生[1]。由于硒在人類和動物體內無法自發合成且易于排泄，因此人類和動物必須以食物鏈中的硒作為攝入來源，以保障其生命機體的正常代謝活動[2]。然而，土壤中硒可利用性低，導致人體硒含量低，這成為一個全球性的公共衛生問題[3]。我國土壤缺硒地區約占國土總面積的72%，且嚴重缺硒地區約占1/3[4]。因此，解決土壤缺硒問題是當前我國乃至全球關注的熱點問題。通過合理的生物富硒既能提高植物的產量和品質，又能增加人類和動物體內硒水平，從而成為提高人類硒攝入水平的關鍵途徑[5-6]。研究發現，噴施硒肥能夠促進玉米(Zeamays)[4]、黑小麥(Triticumaestivum)[6]、水稻(Oryzasativa)[7]等植物生長發育，并提高其籽實產量和硒含量等品質。然而，過量噴施硒肥會抑制植物的生長發育，并造成其產量下降[8]。因此，合理控制硒濃度是富硒農產品生產的關鍵環節[9]。

當前，采用土壤施肥和葉面噴施是農業生產中植物微肥的主要施用方式，而采用種子引發方式則較少[10]。土壤施肥因微肥需求量少而難以均勻撒施，葉面噴施則無法快速緩解根系對微肥缺乏的敏感需求，兩者又均對人力物力的需要較大，這都降低了微肥施用的經濟效益，種子引發則可避免這些局限性[11]。種子引發不僅能提高植物的產量和品質，還能增強植物在逆境條件下的抗氧化能力，抑制其脂質過氧化作用的發生，從而提高其抗逆性[12]。硒引發同樣既能促進植物的生長發育，又能通過提高其抗氧化能力來增強其抗逆性能[13-14]。因此，種子引發被作為一種經濟有效、簡單可行、備受關注的生理策略應用于富硒植物生產[3,15]。然而，硒引發對植物的影響研究仍然較少，致使不同植物種或品種對其響應差異仍不清楚，這嚴重制約了其在生產實踐中的推廣應用。

牧草硒含量水平與草食動物機體健康具有密切關系，進而間接決定著人類身體的健康狀況[16]。紫花苜蓿(Medicagosativa)因適應性強、產量高、再生快、富含優質蛋白質等諸多特性被作為優質牧草在世界各地廣泛種植[17-18]。研究發現，日糧中添加富硒苜蓿草粉既能夠促進家畜增重，又可提高其飼料轉化率和肉品質[16]。因此，如何更好地生產富硒苜蓿產品也就日益被農牧業領域所關注。研究發現，適量濃度的硒引發[14]及基施[19]方式也均會提高紫花苜蓿的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(Aseorbate peroxidase，APX)及過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性，并降低了其丙二醛(Maloddialdehyde，MDA)含量，不僅能促進紫花苜蓿種子萌發及幼苗生長[20]，還能提高其不同生育期的營養品質[21-23]。然而，高濃度硒引發則相反[20]，且不同品種紫花苜蓿種子的萌發及幼苗生長能力均隨硒濃度增加而降低[2]，但不同品種紫花苜蓿的抗氧化酶能力如何響應硒引發則尚未見報道，這對富硒紫花苜蓿生產中最佳品種的篩選極為不利。因此，本試驗以12個紫花苜蓿品種的種子為材料，分析亞硒酸鈉溶液引發不同時間后其抗氧化酶活性及脂質過氧化的變化規律，以期揭示不同紫花苜蓿品種響應硒引發的抗氧化性能差異，并篩選出適宜進行硒引發的紫花苜蓿品種，從而為高質量富硒苜蓿產品的生產提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試材料是品種為‘偏關苜?！?，‘WL168HQ’，‘WL298HQ’，‘WL319HQ’，‘WL343HQ’，‘WL440HQ’，‘WL354HQ’，‘WL363HQ’，‘WL366HQ’，‘WL656HQ’，‘WL712’和‘WL903’的紫花苜蓿種子，‘偏關苜?！N子由山西農業大學草種實驗室在2018年10月收獲于校內基地，其他品種的苜蓿種子由北京正道農業股份有限公司于2019年5月提供，均在2018年8月收獲于美國愛達荷州，所有種子被獲取后均密封保存于種子庫(-20℃)內至2020年11月試驗進行。

1.2 硒引發處理

將飽滿一致的各品種種子分別置于濃度為0.5 mmol·L-1(濃度篩選見參考文獻[14])的亞硒酸鈉溶液，于20℃條件下浸泡0 h(CK)，3 h，6 h，9 h和12 h后，快速用蒸餾水沖洗3遍，并迅速用干濾紙吸完其種皮表面水分后于25℃黑暗條件自然風干至含水量為10%(鮮重基礎)左右。每個處理重復4次。

1.3 發芽試驗

發芽條件及發芽率(Germination percentage，GP)的計算參照國際種子檢驗協會公布的種子檢驗規程(2018)[24]，末次計數為第10 d，具體操作步驟參照文獻[25]。

1.4 生理指標測定

粗酶液參照Kibiza等[26]的方法提取，準確稱取1.0 g種子于室溫條件下用蒸餾水吸脹4 h后冰浴研磨，上清液于4℃條件保存備用，每個指標的測定均取用0.5 mL粗酶液加入3 mL反應體系內。SOD活性測定參照Rao和Sresty[27]的方法，CAT活性測定參照Aebi[28]的方法，APX活性測定參照Nakano和Asada[29]的方法，谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)活性測定參照Madamanchi和Alscher[30]的方法，MDA含量測定參照Bailly等[31]的方法，可溶性蛋白含量采用南京建成科技有限公司所生產的試劑盒測定。

1.5 數據統計與分析

以Excel 2010軟件進行數據整理，并用SPSS 22.0軟件對相同及不同品種紫花苜蓿種子的各指標數據進行單因素方差分析，多重比較(P<0.05)則采用Duncans法進行，最終以平均值±標準誤方式表示結果。

2 結果與分析

2.1 硒引發對不同品種紫花苜蓿種子發芽率的影響

由表1可知，除‘WL712’發芽率在引發9 h時顯著低于引發3和6 h時外(P<0.05)，其他11個品種的紫花苜蓿種子發芽率則隨硒引發時間的延長并未發生顯著變化。相同引發時間下，不同品種的紫花苜蓿種子GP存在很大差異。引發0 h(CK)時，‘WL354HQ’的GP顯著高于‘WL168HQ’，‘WL712’和‘偏關苜蓿’(P<0.05)；引發3 h時，‘WL354HQ’和‘WL366HQ’的GP顯著高于‘WL712’，‘WL903HQ’和‘WL440’(P<0.05)；引發6 h時，‘WL343HQ’和‘WL363HQ’的GP顯著高于‘WL712’(P<0.05)；引發9 h時，‘WL366HQ’，‘WL298HQ’和‘WL319HQ’的GP顯著高于‘WL712’和‘偏關苜蓿’(P<0.05)；引發12 h時，‘WL354HQ’的GP顯著高于‘WL656HQ’，‘WL712’和‘WL903HQ’(P<0.05)。

表1 硒引發對不同品種紫花苜蓿種子發芽率的影響Table 1 Effects of selenium priming on germination percentage of different alfalfa varieties 單位：%

2.2 硒引發對不同品種紫花苜蓿種子超氧化物歧化酶活性的影響

由表2可知，隨硒引發時間的延長，‘偏關苜?！N子SOD活性逐漸升高；‘WL168HQ’，‘WL366HQ’和‘WL440’的SOD活性呈先升高后下降的趨勢，均在引發3 h時達到最大值；其余品種的SOD活性則逐漸下降。未引發(CK)時，‘WL712’，‘WL319HQ’和‘WL903HQ’的SOD活性顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL168HQ’和‘偏關苜?！腟OD活性顯著低于其他品種(P<0.05)；引發3 h時，‘WL712’，‘WL903HQ’和‘WL440’的SOD活性顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL343HQ’的SOD活性則顯著低于其他品種(P<0.05)；引發6 h時，‘WL712’和‘偏關苜蓿’的SOD活性顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL343HQ’的SOD活性仍顯著低于其他品種(P<0.05)；引發9 h時，‘偏關苜?！腟OD活性仍顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL343HQ’，‘WL366HQ’和‘WL440’的SOD活性則顯著低于其他品種(P<0.05)；引發12 h時，‘偏關苜?！腟OD活性顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL363HQ’，‘WL298HQ’和‘WL712’的SOD活性則顯著低于其他品種(P<0.05)。

表2 硒引發對不同品種紫花苜蓿種子SOD活性的影響Table 2 Effects of selenium priming on SOD activity of different alfalfa varieties 單位：U·mg-1 protein

2.3 硒引發對不同品種紫花苜蓿種子過氧化氫酶活性的影響

由表3可知，隨硒引發時間的延長，‘偏關苜蓿’的CAT活性逐漸升高；‘WL319HQ’，‘WL903HQ’和‘WL354HQ’的CAT活性逐漸下降，其余品種的CAT活性則呈先升高后下降的趨勢，‘WL366HQ’，‘WL656HQ’和‘WL712’在引發3 h時達到最大值，而‘WL343HQ’，‘WL363HQ’，‘WL168HQ’，‘WL298HQ’和‘WL440’則在引發6 h時達到最大值。未引發(CK)時，‘WL903HQ’的CAT活性顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘偏關苜蓿’和‘WL656HQ’的CAT活性則顯著低于其他品種(P<0.05)；引發3 h時，‘WL168HQ’和‘WL366HQ’的CAT活性顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘偏關苜蓿’的CAT活性則仍顯著低于其他品種(P<0.05)；引發6 h時，‘WL168HQ’，‘WL298HQ’和‘WL440’的CAT活性顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘偏關苜?！腃AT活性仍顯著低于其他品種(P<0.05)；引發9 h時，‘WL168HQ’和‘WL298HQ’的CAT活性仍顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL656HQ’和‘偏關苜?！腃AT活性則顯著低于其他品種(P<0.05)；引發12 h時，‘WL298HQ’的CAT活性仍顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL656HQ’的CAT活性則仍顯著低于其他品種(P<0.05)。

表3 硒引發對不同品種紫花苜蓿種子CAT活性的影響Table 3 Effects of selenium priming on CAT activity of different alfalfa varieties 單位：U·min-1·mg-1 protein

2.4 硒引發對不同品種紫花苜蓿種子抗壞血酸過氧化物酶活性的影響

由表4可知，隨硒引發時間的延長，‘偏關苜蓿’種子APX活性逐漸升高；‘WL298HQ’，‘WL712’，‘WL440’和‘WL354HQ’的APX活性呈先升高后下降的趨勢，‘WL298HQ’在引發3 h時達到最大值，‘WL712’和‘WL440’在引發9 h時達到最大值，而‘WL354HQ’則在引發6 h時達到最大值；其余品種的APX活性則逐漸下降。未引發(CK)和3 h時，‘WL319HQ’的APX活性顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘偏關苜?！腁PX活性則顯著低于其他品種(P<0.05)；引發6 h時，‘WL440’的APX活性顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL343HQ’，‘WL363HQ’，‘WL168HQ’，‘WL366HQ’和‘偏關苜?！腁PX活性均顯著低于其他品種(P<0.05)；引發9 h時，‘WL440’的APX活性仍顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL366HQ’的APX活性也仍顯著低于其他品種(P<0.05)；引發12 h時，‘WL440’的APX活性仍顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL168HQ’和‘WL366HQ’的APX活性則顯著低于其他品種(P<0.05)。

表4 硒引發對不同品種紫花苜蓿種子APX活性的影響Table 4 Effects of selenium priming on APX activity of different alfalfa varieties 單位：μmol·min-1·mg-1 protein

2.5 硒引發對不同品種紫花苜蓿種子谷胱甘肽還原酶活性的影響

由表5可知，隨硒引發時間的延長，‘WL343HQ’，‘WL363HQ’和‘WL656HQ’的GR活性逐漸下降，其余品種的GR活性則呈先升高后下降的趨勢，‘WL168HQ’，‘WL712’，‘WL319HQ’，‘WL903HQ’，‘WL440’和‘WL354HQ’在引發3 h時達到最大值，而‘WL366HQ’，‘WL298HQ’，‘WL903HQ’和‘偏關苜?！瘎t在引發6 h時達到最大值。未引發(CK)時，‘WL319HQ’的GR活性顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL168HQ’，‘WL712’，‘WL298HQ’和‘偏關苜蓿’的GR活性則顯著低于其他品種(P<0.05)；引發3 h時，‘WL440’的GR活性顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL343HQ’和‘WL363HQ’的GR活性則顯著低于其他品種(P<0.05)；引發6 h時，‘WL366HQ’的GR活性顯著高于‘WL319HQ’和‘WL903HQ’以外的品種(P<0.05)，而‘WL343HQ’的GR活性仍顯著低于其他品種(P<0.05)；引發9 h時，‘WL354HQ’的GR活性顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL343HQ’和‘WL363HQ’的GR活性則顯著低于其他品種(P<0.05)；引發12 h時，‘WL354HQ’的GR活性仍顯著高于其他品種(P<0.05)，而‘WL712’的GR活性顯著低于‘WL343HQ’，‘WL168HQ’，‘WL656HQ’和‘WL903HQ’以外的品種(P<0.05)。

表5 硒引發對不同品種紫花苜蓿種子GR活性的影響Table 5 Effects of selenium priming on GR activity of different alfalfa varieties 單位：U·min-1·mg-1 protein

2.6 硒引發對不同品種紫花苜蓿種子丙二醛含量的影響

由表6可知，隨硒引發時間的延長，‘偏關苜?！N子的MDA含量呈先升高后下降的趨勢，其余11個品種的MDA含量均呈升高的趨勢?！P苜?！腗DA含量在引發3 h時達到最大值，‘WL168HQ’外的其余品種則在引發12 h時達到最大值。引發0(CK)～12 h時，‘偏關苜?！腗DA含量均顯著低于其他品種(P<0.05)；未引發(CK)時，‘WL903HQ’，‘WL168HQ’和‘WL366HQ’的MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05)；引發3 h時，‘WL903HQ’的MDA含量均顯著高于其他品種(P<0.05)；引發6 h時，‘WL903HQ’的MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05)；引發9 h時，‘WL903HQ’和‘WL354HQ’的MDA含量仍顯著高于其他品種(P<0.05)；引發12 h時，‘WL354HQ’的MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05)。

表6 硒引發對不同品種紫花苜蓿種子MDA含量的影響Table 6 Effect of selenium priming on MDA content of different alfalfa varieties 單位：μmol·mg-1 protein

3 討論

適宜的硒處理能夠促進植物種子的萌發及其幼苗生長[3,20]。張士敏等[32]研究不同硒源及濃度對‘偏關苜?！N子萌發的影響時也發現了這一現象。然而，本試驗中，硒引發下12個品種的紫花苜蓿種子GP與CK相比并未發生顯著變化，這與彭琪等[33]的研究結果相似，可能是因為硒引發促進了種子內蛋白質、多糖及核糖等大分子貯藏物質的分解，為其萌發過程的細胞快速分裂提供了充足的能量基礎和物質保障[34]。因此，利用硒引發進行富硒苜蓿草產品生產時，本試驗中12個品種的紫花苜蓿沒有發生因田間出苗率下降而造成減產的現象。

硒被認為是直接參與動植物體內抗氧化等多種代謝反應的重要微量元素[35]，適宜的硒處理能提高紫花苜蓿[14]、黑小麥[34]、遏藍菜(Thlaspiarvense)[36]及生菜(Lactucasativa)[37]等植物的抗氧化性能。本試驗中，12個品種紫花苜蓿種子的SOD，CAT，APX及GR活性在引發3～6 h時仍保持較高活性，這可能是短時間(3～6 h)的硒引發下其SOD活性仍保持較高水平，產生并積累了大量的H2O2，從而誘導了其CAT，APX和GR活性升高[38]，因而其MDA含量也增加幅度相對較小，這與低濃度的硒引發對水稻[3]、紫花苜蓿[14,19]和生菜[37]等植物抗氧化性能的影響相似。然而，植物適應硒的生理活性范圍往往相對較窄，過量或缺乏均會對植物的生理代謝產生負面影響[35,38]。本試驗中，除‘偏關苜?！猓溆?1個品種的CAT，SOD，APX和GR活性在硒引發12 h時均已下降，這可能是H2O2的過量積累[3,38]以及硒非特異性地結合了蛋白質[39]，從而造成了其細胞膜系統的脂質過氧化損傷，表現為MDA含量均顯著高于CK(P<0.05)，‘WL343HQ’，‘WL363HQ’，‘WL656HQ’，‘WL319HQ’和‘WL903HQ’尤為突出，這與水稻[3]、紫花苜蓿[14]和生菜[37]等植物的研究發現相似。盡管引發12 h時，12個品種紫花苜蓿種子的GP均無顯著變化，但僅有‘偏關苜蓿’仍保持較高的抗氧化能力，這可能是硒處理對紫花苜蓿種子GP無影響，卻會抑制其幼苗生長的原因[33]，因而說明不同品種紫花苜蓿種子的耐硒能力存在很大差異[2]，除‘偏關苜?！獾淖匣ㄜ俎Ｆ贩N已不適宜繼續進行硒引發。代惠萍等[40]也發現，不同品種紫花苜蓿葉片SOD，CAT，APX和POD活性存在顯著差異，‘大葉苜?！目寡趸芰ψ罡撸S多利亞’最差，這與本試驗現象類似。因此，不同品種紫花苜蓿的抗氧化能力對硒引發的響應存在差異，在其富硒生產應用中應謹慎選擇品種，本試驗研究對象中以‘偏關苜?！贩N最適宜用于富硒苜蓿產品的生產。

4 結論

外源硒引發對12個品種紫花苜蓿種子的發芽率基本無顯著影響，但對其抗氧化能力的影響存在明顯差異。短時間(3～6 h)硒引發時，大多數紫花苜蓿種子保持較高的抗氧化能力，而除‘偏關苜?！?，其余11個品種的抗氧化能力均在長時間(12 h)硒引發時顯著降低(P<0.05)，因而‘偏關苜?！钸m宜采用引發技術進行富硒草產品生產，而‘WL343HQ’，‘WL363HQ’，‘WL656HQ’，‘WL319HQ’和‘WL903HQ’則最不適宜。